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胸腺素β4作为新近发现的能同时具有抑制细菌生长和促进伤口愈合两种功能的重要基因,在斑节对虾中未展开研究。本研究克隆了斑节对虾胸腺素β4(Pmβ4)基因,并对其在抗菌免疫和伤口愈合中的作用进行了探究。通过液体培养基法和酶联免疫吸附实验研究了Pmβ4在体外的抑菌活性。借助RNAi和过表达等技术明确了Pmβ4对血淋巴中副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)的清除作用以及Pmβ4对对虾存活率的影响。通过RNAi和过表达等技术探究了Pmβ4和伤口愈合关键基因(过氧化氢基因catalase和超氧化物歧化酶基因superoxide dismutase)的关联关系。通过制备组织切片进一步明确了Pmβ4对于伤口愈合的影响。初步揭示了斑节对虾Pmβ4在先天免疫和伤口愈合中的作用机制,为对虾养殖过程中出现的病原感染和防治,及创伤修复等问题的解决提供理论支持。(1)在转录组中获得Pmβ4 c DNA序列全长。开放阅读框有501 bp,编码166个氨基酸。预测蛋白分子量18714.05 D,等电点5.75。多重序列比对和进化树结果显示,斑节对虾Pmβ4与其他对虾胸腺素β4相似性较高且聚为一支,其中与日本囊对虾(Penaeus japonicas)亲缘关系最近。组织分布发现Pmβ4在斑节对虾的血淋巴、淋巴和肝胰腺等免疫器官中中大量表达。(2)本研究从体内和体外两个水平进行探究Pmβ4的抗菌能力。体外水平,在酶联免疫吸附实验(ELISA)实验中,当蛋白浓度从64μg/m L到128μg/m L时,副溶血弧菌、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)结合活性呈现较强的剂量依赖效应,显示出高结合活性。液体培养法中对创伤弧菌、副溶血弧菌、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较强的抗菌活性,说明重组蛋白Pmβ4在体外具有广谱抗菌活性且敏感度不同。体内水平,首先在免疫刺激实验中,注射哈维氏弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌后Pmβ4表达水平呈现上升趋势并达到峰值,随后仍维持较高水平。通过原位杂交和q RT-PCR实验证明ds RNA方法成功干扰Pmβ4。注射副溶血弧菌,通过取血淋巴涂平板的方法推算出干扰组的菌浓度显著高于空白对照组,此时对应的斑节对虾死亡个数增加;而注射重组蛋白Pmβ4过表达组的结果与干扰组结果截然相反,说明Pmβ4参与了斑节对虾的免疫防御过程。(3)为了研究Pmβ4是否具有伤口愈合的作用,探究是如何促进伤口修复的具体作用机制。首先在制造伤口分析Pmβ4在血淋巴中的相对表达量,发现12 h后达到峰值,有一个明显的上升趋势,初步推测Pmβ4与斑节对虾伤口愈合有关联。然后通过沉默和过表达Pmβ4 24小时后制造伤口检测伤口愈合基因的表达情况发现,干扰后CAT和SOD基因表达水平均显著降低,过表达后基因表达水平显著升高。表明Pmβ4可能通过调控抗氧化基因的表达从而参与伤口修复过程。(4)为了深层次探讨Pmβ4是如何参与伤口修复过程,通过组织切片观察肌肉伤口情况。发现受损肌肉组织结构发生变化且被血细胞浸润,一圈被黑色素包围,随后最外层开始坏死。而干扰组早于空白组出现坏死现象;但过表达组未观察到坏死区域。说明Pmβ4能延迟创伤坏死。充分证明Pmβ4可能通过调控伤口愈合基因的转录,延缓伤口坏死从而促进愈合。