论文部分内容阅读
第一部分新型化合物RCM1对气道上皮club细胞内FOXM1的作用研究目的:验证新型化合物RCM1在体内对转录因子FOXM1的抑制作用。方法:使用CCSP-rtTAtg/-/tetO-FOXM1th/-转基因鼠,鼻内滴入屋尘螨(House Dust Mite. HDM)经DOX刺激后气道上皮club细胞内过表达FOXM1,采用RCM1腹腔注射进行干预,观察转基因鼠气道上皮细胞内FOXM1表达情况,并同时使用Rael-time PCR、免疫组织化学染色及Western Blot进行研究。结果:经HDM气道内刺激并经DOX激发后,转基因鼠气道上皮club细胞内过表达FOXM1,荧光显微镜观察可见RCM明显抑制club细胞FOXM1表达,Rael-time PCR、免疫组织化学染色及Western Blot也证实RCM1明显抑制club细胞内Foxm1基因转录及蛋白水平表达。结论:RCM1可明显抑制转基因鼠气道上皮club细胞及达FOXM1。第二部分FOXM1抑制剂RCM1对支气管哮喘小鼠气道杯状细胞化生及气道炎症反应的作用研究目的:探索RCM1对支气管哮喘模型小鼠气道杯状细胞化生、肺部炎症及气道高反应性的作用。方法:使用HDM气道激发Balb/c小鼠制备支气管哮喘急性期模型,采用腹腔注射RCM1方式进行干预,实验鼠分为四组:A组:生理盐水滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;B组:生理盐水滴鼻+腹腔注射RCM1; C组:HDM滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;D组:HDM滴鼻+腹腔注射RCM1。在进行最后一次HDM气道内激发后24小时获取标本,进行下列检测:(1)肺组织Real-time PCR定量检测气道杯状细胞化生相关基因 Fxom1、Spdef、Foxa2、Foxa3、Scgb1a1、Agr2、Muc5ac及炎症反应相关基因 Cc12、Cc111、Cc124、Ccr2、Ccr3、Cx3c11、Cx3cr1、IL-4、IL-5、IL-12p35、IL-13、IL-33、Acta2、Ptgs2、Ltc4smRNA 水平;(2)进行肺组织 HE、Alcian Blue及免疫组织化学染色评估气道杯状细胞化生、粘液分泌、炎症反应及气道上皮细胞内FOXM1、SPDEF、MUC5AC、FOXA2、CCSP表达情况,肺组织学评分评估肺组织炎症反应程度;(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数并使用流式细胞仪分析肺泡巨噬细胞、浸润巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞的变化;(4)测定BALF中IFNγ、IL-4、IL-5、IL-13细胞因子水平;(5)使用乙酰甲胆碱进行气道激发,FlexiVent系统进行气道动力学参数测定,观察支气管哮喘小鼠气道阻力、气道顺应性、中心气道及周围气道阻力变化情况。结果:(1) RCM1有效抑制HDM诱发的Balb/c小鼠气道上皮杯状细胞化生,减轻气道粘液过度分泌,降低肺组织内Fxom1、Spdef、Foxa3、Agr2、Muc5ac表达,有上调Foxa2及Scgb1a1转录,增加FOXA2、CCSP表达趋势,并减少气道上皮细胞内FOXM1、SPDEF、MUC5AC表达。(2) RCM1明显减轻HDM诱发的肺组织炎症反应,降低炎症趋化因子Cc12、Ccl11、Ccl24、Ccr2、Ccr3及细胞因子IL-5、IL-13、IL-33mRNA水平,下调BALF内IL-4、IL-5、IL-13水平,并上调IFNγ水平,减少HDM导致的肺组织学评分升高;(3) RCM1未减少HDM诱发的BALF中细胞数增多,但可明显减少T淋巴细胞及中性粒细胞的数量;(4) RCM1可明显降低气道阻力,提高肺组织顺应性。结论:RCM1可有减轻支气管哮喘小鼠气道杯状细胞化生、气道粘液分泌及肺组织炎症,并可降低气道阻力,提高肺组织顺应性。RCM1有潜力成为治疗哮喘的新型药物。第三部分FOXM1抑制剂RCM1对IL-13诱导的气道炎症反应的作用及机制研究目的:观察FOXM1抑制剂RCM1对IL-13诱导的气道杯状细胞增生及炎症反应的作用,并结合体外实验探索RCM1的作用机制。方法:1.体内实验:使用重组鼠IL-13气道激发Balb/c小鼠制备气道炎症模型,采用腹腔注射RCM1方式进行干预,实验鼠分为四组:A组:生理盐水滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;B组:生理盐水滴鼻+腹腔注射RCM1; C组:IL-13滴鼻+腹腔注射RCM1溶媒;D组:IL-13滴鼻+腹腔注射RCM1。在进行最后一次IL-13气道内激发后24小时获取标本,进行下列检测:(1)肺组织Real-time PCR定量检测气道杯状细胞化生相关基因Fxom1、Spdef、Foxa2、Foxa3、Scg1a1、Agr2、Muc5ac 及炎症反应相关基因 Ccl2、Ccl11、Ccl20、Ccl24、Ccr3、Ccr6、Cx3cl1、Cx3cr1、Ifng、IL-4、IL-5、IL-12p35、IL-13、IL-25、IL-33、Acta2、Ptgs2、Ltc4s mRNA水平;(2)进行肺组织HE、Alcian Blue及免疫组织化学染色评估气道杯状细胞化生、粘液分泌、炎症反应及气道上皮细胞内FOXM1、SPDEF、MUC5AC、FOXA2表达情况;(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞计数及分类分析,测定BALF中IFNγ、IL-4、IL-5、IL-33细胞因子水平;(4)Western Blot测定肺组织中转录因子 FOXM1、STAT6、p-STAT6、ERK1/2、p-ERKl/2、AKT、p-AKT、ERK5、p-ERK5、14-3-3水平,以β-actin作为内参;(5)使用乙酰甲胆碱进行气道激发,FlexiVent系统进行气道动力学参数测定,观察实验小鼠小鼠气道阻力、气道顺应性、中心气道及周围气道阻力变化情况。(6)留取实验鼠外周血血清检测各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CPK)、尿素氮(BUN)、总蛋白(Total Protein)、白蛋白(Albummin)、碱性磷酸酶(ALP)水平变化,并对小肠绒毛进行形态学观察。2.体外实验:对正常人气道上皮细胞(NHBE cells)进行体外培养,加入重组人IL-13 (1Ong/μL)进行刺激前1小时用RCM1进行干预,2-24小时收集细胞,Western Blot 法检测细胞中转录因子 FOXM1、STAT6、p-STAT6、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT、ERK5、p-ERK5、14-3-3 水平,以 β-actin 作为内参。结果:(1) RCM1有效抑制IL-13诱发的Balb/c小鼠气道上皮杯状细胞化生,减轻气道粘液过度分泌,降低肺组织内Fxom1、Spdef、Foxa3、Muc5ac表达,并减少气道上皮细胞内FOXM1、SPDEF、MUC5AC表达,对Foxa2基因转录及蛋白表达无明显影响,对IL-13上调Agr2及下调Scgb1a1表达无明显影响;(2)RCM1明显减轻IL-13诱发的气道炎症反应,降低炎症趋化因子Ccl2、Ccl11、Ccl24及细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-25、IL-33 mRNA水平,下调BALF内IL-4、IL-5水平,IL-13促进BALF中IL-33升高,RCM1未对其产生影响,IL-13及 RCM1 对肺组织中 Ccl20 Ccr3、Ccr6、Cx3cl1、Cx3cr1、IL-12p35、Acta2、Ptgs2 mRNA水平无明显影响;(3) IL-13及RCM1对BALF中细胞总数及巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数量无明显影响;(4) RCM1可明显降低IL-13所导致的实验小鼠气道阻力升高及肺组织顺应性降低,起到保护肺功能作用。(5)利用肺组织及NHBE细胞进行Western Blot检测显示,RCM1可有效抑制IL-13刺激所导致的FOXM1表达增强,RCM1也抑制了 ERK1/2的总量及磷酸化水平,IL-13 及 RCM1 对 STAT6、p-STAT6、AKT、p-AKT、ERK5、p-ERK5、14-3-3无明显影响。(6) RCM1对实验小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST )、肌酸磷酸激酶(CPK)、尿素氮(BUN )、总蛋白(Total Protein)、白蛋白(Albummin)、碱性磷酸酶(ALP)及小肠绒毛杯状细胞未产生明显影响。结论:RCM1通过抑制细胞FOXM1表达,阻断IL-13/STAT6信号传导通路达到减轻气道杯状上皮细胞化生及气道炎性反应、降低气道阻力的作用,提示RCM1是一种优良无毒的、具有潜力开发成为哮喘治疗药物的小分子化合物。