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目的：为研究EBI3蛋白的生物学功能,构建带有FLAG标签的EBI3、带GFP标签的EBI3和带有HA标签的EBI3真核表达载体,瞬时转染至COS7细胞,观察表达的蛋白在细胞内的定位;将EBI3与Sedlin真核表达载体质粒共同瞬时转染至COS7细胞,观察各组蛋白在细胞内的共定位情况;将EBI3与Sedlin共同转染至HEK293T细胞,用免疫共沉淀实验检测EBI3蛋白与Sedlin蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。 方法：用PCR方法,以含人EBI3全长cDNA序列的质粒pGBKT7-EBI3为模板,扩增EBI3全长序列,酶切回收目的片段,插入到载体pCDNA3.1、pCDGFP上,构建真核表达载体pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDGFP-EBI3和pCDNA3.1-EBI3-HA。用PCR方法,用引入了点突变的引物,以pCDNA3.1-EBI3-FLAG为模板,构建表达载体pCDNA3.1-D210A-FLAG。重组质粒经酶切鉴定正确的送测序公司测序。 分别将pCDNA3.1-EBI3-FLAG和pCDGFP-EBI3质粒瞬时转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察各种蛋白的细胞定位;pCDNA3.1-EBI3-FLAG、pCDGFP-EBI3分别与pCDGFP-Sedlin、pCDNA3.1-Sedlin-FLAG共同转染至COS7细胞,荧光显微镜下观察各组蛋白在细胞内的共定位;将EBI3与Sedlin共同瞬时转染至HEK293T细胞,通过免疫共沉淀实验检测EBI3蛋白与Sedlin蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用。 结果：经过酶切和测序鉴定,证明各质粒均构建正确。pCDNA3.1-EBI3-FLAG转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察到,EBI3蛋白主要分布在细胞质中,核内分布不明显;pCDGFP-EBI3转染至COS7细胞中,也可观察到相同的结果。pCDNA3.1-EBI3-FLAG与pCDGFP-Sedlin共同转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察到,EBI3与Sedlin在细胞质中有部分共定位。pCDGFP-EBI3与pCDNA3.1-Sedlin-FLAG共同转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察到,EBI3与Sedlin共定位主要在细胞质中,细胞核也可见部分共定位,共定位情况与pCDNA3.1-EBI3-FLAG与pCDGFP-Sedlin的共定位基本相同。pCDNA3.1-EBI3-FLAG与pCDGFP-Sedlin免疫共沉淀实验表明,在HEK293T细胞中,EBI3蛋白与Sedlin蛋白存在相互作用。 结论：在COS7细胞中,EBI3与Sedlin蛋白存在共定位;免疫共沉淀实验进一步证明了在HEK293T细胞中,EBI3与Sedlin蛋白存在相互作用。