牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水养殖经济鱼类,雌性个体的生长速度明显快于雄性个体,因而关于牙鲆性别分化及生殖调控的研究成为目前研究的热点。Kisspeptin/Gpr54系统的发现及其鉴定是神经内分泌学的一项重大突破,也是脊椎动物生殖研究领域的一场新革命。目前关于Kisspeptin系统的研究主要集中在哺乳类动物,在鱼类中的研究仅仅处于起步阶段,而在牙鲆中仍未见报道。因此,本研究克隆了牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因,检测了二者在牙鲆早期发育阶段及成体各组织的表达情况;运用western-blot和免疫组化方法检测了Gpr54-2蛋白在牙鲆脑、性腺和肝脏组织中的表达情况,以期为进一步阐明kiss2基因在牙鲆生殖中的作用提供基础。其主要结果如下:1牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因的分子鉴定从牙鲆脑组织中克隆得到牙鲆kiss2及其受体gpr54-2基因c DNA序列。其中获得的牙鲆kiss2c DNA长度为449 bp,该序列包括一段83 bp的3’非翻译区和一段编码121个氨基酸残基的366 bp开放阅读框;牙鲆gpr54-2 c DNA全长为2556bp,该序列包括1143bp的开放阅读框,899bp的5’非翻译区(UTR)及504bp的3’非翻译区,编码380个氨基酸。系统进化树分析结果表明,牙鲆Kisspeptin与脊椎动物Kisspeptin-2聚为一支;牙鲆Gpr54-2鱼类Gpr54-2聚为一支。氨基酸相似性分析表明,牙鲆Kisspeptin2与条纹鲈(Morone saxatilis)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)及斑马鱼(Danio rerio)Kisspeptin2的同源性分别为76%、74%、69%和28%。牙鲆Gpr54-2与大西洋庸鲽(Hippoglossus hippoglossus)、塞内加尔鳎(Solea senegalensis)及斑马鱼(Danio rerio)的Gpr54-2的同源性分别为98%、93%和88%。2 kiss2及gpr54-2在牙鲆成体各组织的表达分布采用实时荧光定量PCR检测了kiss2及其受体gpr54-2基因在牙鲆成体各组织的表达分布情况。其中牙鲆kiss2基因在脑中的表达量最高,在肝、鳃、肠和卵巢中次之,在肌肉、精巢和心脏中的表达量较低,而在胃和肾中没有检测到kiss2基因的表达。而gpr54-2基因在所检测的牙鲆组织包括脑、肌肉、心脏、鳃、肾、胃、肝脏、肠、性腺中都有表达,但表达量差异很大。其中gpr54-2在牙鲆脑组织中的表达量最高,其次是性腺组织,且在卵巢的表达量稍高于精巢,而在其它组织中的表达量则相对较低。kiss2及其受体gpr54-2在牙鲆脑中的丰富表达及在精卵巢中的较高表达表明二者很有可能与牙鲆神经系统和生殖发育相关。3 kiss2及gpr54-2在牙鲆早期不同发育阶段的表达图式实时荧光定量结果显示,在牙鲆未受精卵没有检测到kiss2的表达,且在胚胎发育期间均保持较低的表达水平。而在孵化后仔鱼中kiss2基因的表达量明显升高,至孵化后第29天(29 dph)达到高峰。gpr54-2基因在牙鲆胚胎及仔鱼阶段都有表达,在胚胎发育早期其表达量相对较低,而在孵化后仔鱼中表达量升高。至孵化后第36天(36 dph)达到高峰。这些结果表明kiss2及其受体gpr54-2基因在牙鲆早期发育阶段的表达趋势基本一致。4 Gpr54-2蛋白在牙鲆成体组织中的表达情况采用多肽亲和法制备了牙鲆Gpr54-2蛋白多克隆抗体。应用该抗体,Western-blot结果显示,Gpr54-2蛋白在牙鲆脑、精巢和卵巢中均有明显的表达,而在牙鲆肝组织中仅有较弱的表达。但应用该抗体的免疫组化结果显示各组织信号不明显,表明该抗体可能不适用于免疫组化实验。本研究结果为后续深入探讨kiss2及其受体gpr54-2基因在牙鲆性别分化及生殖的作用打下了基础。