第一部分 海藻施万菌适应高盐环境的转录组变化分析海藻施万菌是一种可以产河豚毒素的、在水环境中生存的细菌,可能会引起椎间盘炎、血性腹泻等,能够在多种环境下生存,从腐烂的食物、感染的动物、病人的血液和拭子标本、淡水湖、深海中都可以分离到施万菌。海藻施万菌是一种耐高盐环境的细菌,本研究对海藻施万菌进入高盐环境下不同时间点的转录组进行了测序,分析其差异,并对可能涉及的相关的耐盐基因进行了分析。在本研究中,共确定了1808个转录差异基因,占海藻施万菌总基因数的41.5%(1808/4354)。其中大约40.3%的差异基因属于假想蛋白,包括未知功能的基因。有20.9%的差异基因属于多种代谢相关的基因,包括碳源代谢、氨基酸代谢等。另外一些膜转运体、细胞动力基因、DNA复制和修复系统以及信号传递系统等基因转录水平改变明显。细菌进入高盐环境下一个重要的反应是排出钠离子,摄入钾离子,并且通过从外界转运外源谷氨酸和自身合成谷氨酸来中和阳离子蓄积带来的正电荷等,从转录组分析上,显示海藻施万菌也表现出类似的反应。另外,还发现海藻施万菌中,肽聚糖合成以及DNA合成修复相关基因、核糖体大小亚基等基因转录上调明显。能量代谢方面,三羧酸循环和糖酵解途径中的关键酶在1h时转录下调,而在4h或14h时回升到原来水平或上调。厌氧呼吸中的关键酶在三个时间点都升高明显。通过本研究,我们对海藻施万菌应对高盐压力的机制做了一个时序性的动态分析,明确了海藻施万菌在进入高盐环境后启动的应对高盐压力的多种途径。第二部分霍乱弧菌外膜蛋白OmpW转运相容性溶质以抵抗高盐环境霍乱弧菌是一种能引起严重腹泻的肠道致病菌,其生存中需要克服不同环境压力包括海水和食物中的高盐压力。为分析霍乱弧菌适应高盐环境基因转录变化,根据在其他细菌中研究的耐盐相关基因,我们挑选了Sigma因子、Na/K离子转运通道、谷氨酸合成基因、肽聚糖合成基因等可能的高盐相关基因,利用real-time PCR array的方法对分离自不同时间和地点的4株01群和4株0139群霍乱弧菌在高盐条件下的转录水平进行了研究。这8株霍乱弧菌的耐盐程度介于4%-6%之间,O1群和0139群的耐盐程度没有明显差异。Real-time PCR array的结果显示,霍乱弧菌在抵抗高盐环境时的一些基本机制同其他细菌相类似,8株菌中都有K离子摄入基因转录上调,Na离子摄入基因转录下调,谷氨酸合成基因转录上调等。其中有3个Sigma因子(regulator of sigma D、RNA polymerase sigma-70 factor, ECF subfamily和Sigma-54 modulation protein)在8株菌中的转录水平几乎都上调,说明这三个Sigma因子对霍乱弧菌应对高盐环境具有重要的意义。重要的是,这8株菌具有菌株特异性的现象。Sigma因子和肽聚糖合成基因在不同的菌株中转录水平改变不同。通过HCL聚类分析发现,基因转录水平的改变同霍乱弧菌的耐盐程度相关,如在高耐盐组中,RpoS. RpoH和RpoN等Sigma因子的基因转录水平升高,而低耐盐组中转录水平不变或降低。我们推测对霍乱弧菌来说,除了招募共同的Sigma因子外,高耐盐组的菌株可能会招募更多的Sigma因子来启动高盐应激反应。另外霍乱弧菌的这种菌株特异性现象,提示在研究细菌的耐盐机制时应该挑选多个菌株来进行分析,寻找共有机制。针对一些细菌的研究,显示外膜蛋白OmpW可以提高菌株的耐盐能力。另有些研究显示OmpW可以转运一些物质,例如鼠伤寒沙门菌(Salmonellaenteric serovar Typhimurium) OmpW同一种除草剂甲基紫精(一种季铵类化合物)的转运有关。耐盐相关的相容性溶质很多也是四价阳离子化合物,如甜菜碱、胆碱、肉碱以及氨基酸类的如甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸等,在细菌应对渗透压时起了重要的作用。在本研究中我们发现在高盐浓度下,ompW基因转录也上调。我们对霍乱弧菌OmpW是否与耐盐相关也进行了研究。对研究的O1群E1 Tor型流行菌株进行了ompW基因缺失,发现缺失ompW基因后,菌株耐盐能力降低；另外,曾在四川流行过的ompW基因天然缺失菌株(噬菌体生物分型为6b)也纳入本研究,对其进行了ompW基因回补,发现回补完整的ompW基因后,绝大多数菌株的耐盐能力升高,说明ompW基因同霍乱弧菌的耐盐能力相关,可以提高霍乱弧菌的耐盐能力。在M9培养基中加入甜菜碱、赖氨酸、肉碱后霍乱弧菌的耐盐能力升高,加入其它相容性溶质则未见耐盐能力的提高,说明霍乱弧菌可能主要以这三种物质作为相容性溶质来抵抗高盐压力。加入相容性溶质肉碱后,霍乱弧菌野生株耐盐能力升高,而其ompW缺失株耐盐能力不变,提示OmpW同相容性溶质肉碱的转运相关。因此,通过本研究,我们获得了霍乱弧菌适应高盐环境的耐盐相关基因的转录变化,并且发现霍乱弧菌外膜蛋白OmpW可通过转运相容性溶质肉碱来提高霍乱弧菌的耐盐能力。