干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。目前已经成功分离培养包括来自骨髓、肌肉、神经、上皮等组织的成体干细胞。牙髓干细胞是位于牙髓组织的一种成体干细胞。2000年，Gronthos等首先成功地分离培养出人牙髓干细胞，为干细胞的研究开辟了一个新的领域。牙髓干细胞具有同其他成体干细胞相似的生物学特性，具有较强的克隆形成能力，可以分化为牙髓组织中的终末功能细胞并具有一定的横向分化能力。目前国内外只有人牙髓干细胞培养成功的报道，鼠牙髓干细胞的相关研究国内外还未见报道，而鼠是实验研究最常用的模型，它具有取材容易、与人同源性较高等优点，因此本研究以大鼠为实验对象，采用细胞克隆分离培养方式进行大鼠牙髓干细胞的培养，同时对大鼠牙髓干细胞进行了一系列生物学特性研究，为牙髓干细胞的研究增加了新的内容，为牙齿再生的研究奠定基础。 第一部分：大鼠牙髓干细胞的分离培养及鉴定 本部分实验采用细胞克隆分离培养的方式，对大鼠牙髓细胞进行克隆筛选，将获得的单细胞克隆来源的细胞进行体外诱导分化及体内接种实验，结果共获得4株单细胞克隆来源细胞株(282、6A11、8A1、8A7)，对282细胞株进行矿化液诱导，部分细胞出现细长的单个胞浆突起，与成牙本质细胞胞浆突起相似，同时出现牙本质特异性蛋白DSPP的表达。裸鼠体内种植实验结果表明，该株细胞经过8周的体内种植后，形成了类牙髓牙本质复合体结构，该结构具有前期牙本质、矿化牙本质、成牙本质细胞层及牙髓组织，第四军医大学博士学位论文与正常牙髓牙本质复合体结构相似，并表达牙本质特异性蛋白DSP。 第二部分:大鼠牙髓千细胞的生物学特征分析 首次培养成功的细胞株明确其生物学特征至关重要，本部分实验研究了大鼠牙髓干细胞的形态学、生长及增殖、矿化能力、细胞克隆形成等一系列细胞生物学特征，同时对大鼠牙髓干细胞的细胞周期与核型进行了检测，旨在通过一系列细胞生物学研究方法对所获得的2B2株牙髓干细胞进行综合分析及评测。结果显示大鼠牙髓干细胞2B2株为成纤维细胞样生长，细胞密集区可见多角形或椭圆形细胞。从细胞生长曲线图来看，大鼠牙髓千细胞的生长能力弱于大鼠骨髓间充质干细胞，其生长曲线在8一10天达到最大值，该细胞株群体倍增时间为58.3小时。大鼠牙髓干细胞的克隆形成率为2.55%，较第一部分大鼠牙髓细胞的克隆形成率为高。细胞核型及致瘤性检测表明该细胞株无染色体畸形及致瘤性等肿瘤细胞特性。大鼠牙髓千细胞经过一定的诱导后，出现了矿化结节，表明具有一定的矿化能力。以上对牙髓干细胞的生物学特性研究为其进一步的功能学研究奠定了基础。 第三部分:大鼠牙髓千细胞的功能学特征分析 本部分实验从三个方面对大鼠牙髓干细胞2B2株进行研究。实验一采用免疫组织化学的方法进行了大鼠牙髓干细胞相关蛋白的检测。研究结果表明，未经诱导的大鼠牙髓干细胞DMPI仅个别细胞阳性表达，DSP少量细胞阳性表达，而CBFAI、BMPZ为阳性染色。经矿化液7一10天的诱导后，大鼠牙髓干细胞DSP染色出现部分细胞强阳性，DMPI出现阳性表达，表明矿化液的诱导使部分大鼠牙髓干细胞具有了成牙本质细胞的特征。实验二对大鼠牙髓干细胞的脂肪、神经、肌肉转分化进行研究。在对大鼠牙髓干细胞进行适当的诱导后，采用RT一PCR的方法对诱导前后相关特异性蛋白mRNA的表达进行检测，结果表明:大鼠牙髓干细胞可以向脂肪细胞系进行转分化，表明具有一定的横向分化能力，而向神经及肌肉细胞系方向的分化没有阳性结果，表明常规诱导条件下，大鼠牙髓干细胞不具备向神经细胞系、肌细胞系横向分化的能力。实验三采用TGF一p做为细胞诱导因子，对大鼠牙髓干细胞进行一定的诱导，研究其生物学特性的改变。结果表明经过TGF一p诱导后，大鼠牙髓干细胞内总蛋白含量增加，细胞生长及增殖能力明显增强，碱性磷酸酶活性增强表明该细胞具有了更强的矿化能力，诱导后出现DSPP第四军医大学博士学位论文的阳性表达表明TGF一p可以促使该细胞株向成牙本质细胞方向分化。 综上所述，本研究以大鼠作为研究对象，采用细胞克隆分离培养模式首次成功获得了大鼠牙髓千细胞2B2株，并对其进行了鉴定。在此基础上对该细胞株的细胞生物学特性进行了一系列的研究，为牙髓干细胞研究领域提供了新的研究工具，为牙齿再生及牙齿发育研究奠定了基础，具有重要的理论意义和潜在的临床应用前景.