动脉粥样硬化(atheroscleosis,AS)是冠心病、中风等心脑血管疾病的主要病理基础。随着生活水平的提高和生活方式的改变,由AS所致的心脑血管疾病已经成为严重危害人类健康的疾病之一,在我国其发病率也有逐年上升的趋势,且发病年龄趋向年轻化。因此,研究开发抗AS的药物并探索其作用机制无论在实际应用或理论价值方面均具有重要意义。　　 AS具体的发病机制十分复杂。其中“氧化应激损伤机制”学说比较受公认:一般认为,体内氧化应激水平增高一方面可以造成血管内皮细胞损伤,这被认为是AS形成的始动因素；另一方面氧化修饰体内的低密度脂蛋白(low densitylipoproteins,LDL),形成氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL,ox-LDL),后者可以通过相应的受体被巨噬细胞不受控制地大量吞入,从而造成胞内胆固醇、胆固醇酯的大量聚积,最后导致泡沫细胞形成。而泡沫细胞凋亡或坏死后将脂质释放出来,形成粥样硬化斑块的主要成分。目前认为,AS既是一种慢性免疫炎症性疾病,又是一种脂质沉积的纤维增生性疾病,是一个漫长的多因素相互作用的综合性过程。　　 Ca2+是细胞内重要的信号转导因子,动脉粥样硬化的发生与细胞ca2+运动功能失调密切相关。细胞膜上存在电压依赖性Ca2+通道(voltage-dependent calciumchannel,VDCC)、受体操纵性Ca2+通道(receptor-operated calcium channel,ROCC)和Ca2+池操纵性Ca2+通道(store-operated Ca2+channel,SOCC)。维持胞内Ca2+稳态具有重要的意义,如果胞内钙的动态平衡被破坏,将导致细胞死亡。研究表明:钙通道阻滞剂(calcium channel blocker,CCB)氨氯地平、硝苯地平等可通过抑制跨细胞膜钙内流来减少胞内胆固醇聚积,降低血小板聚集和纤维蛋白原的活性从而抑制AS的形成。研究证实CCB在脂代谢紊乱及动脉硬化治疗中具有重要地位,但大量的实验研究对象都是作用于VDCC的CCB(如氨氯地平、硝苯地平等),其机制主要是阻滞经VDCC的Ca2+内流从而发挥保护血管的作用。目前还缺少研究ROCC和SOCC与动脉粥样硬化关系的报道。　　 人参是我国著名的传统珍贵中药,具有广泛的药理作用。1982年以来人参总皂甙已用于临床防治心血管疾病,其中的三七人参皂甙Rc具有抗血栓形成、抗动脉硬化作用；皂甙Rb1、Rb2和Rb3对自由基损伤的大鼠心肌细胞具有钙通道阻滞作用；Re、Rb1、Rg1、Rg2、Rh1兼有抗自由基和钙通道阻滞作用等。研究证实,三七人参皂甙Rd(Ginsenoside-Rd)具有增强免疫功能,保护心血管等多种生物活性,但三七人参皂甙Rd对动脉粥样硬化的作用还有待研究。　　 本实验室的系列研究证实:三七人参总皂甙能够通过抑制α-肾上腺素受体操纵的Ca2+内流从而舒张血管(1985年)；能够减少苯肾上腺素诱导的45Ca2+内流和胞浆游离Ca2+浓度的水平而对氯化钾诱导的45Ca2+内流和胞浆游离Ca2+浓度水平的增加无影响。同时,也不改变苯肾上腺素诱导的由胞浆内Ca2+释放引起的45Ca2+外流和α-肾上腺素受体的亲和力(1988年,1994年)。这些研究说明三七人参总皂甙能够抑制受体操纵性的Ca2+内流。此后,我们又首次发现从其中提取的单体三七人参皂甙Rd能减弱苯肾上腺素诱导的血管收缩反应而对氯化钾诱导的血管收缩无作用,而其它单体不具有这一独特活性。经过深入研究我们又证实:在血管平滑肌细胞上,三七人参皂甙Rd能够显著地抑制经ROCC和SOCC介导的Ca2+内流,而对经VDCC介导的Ca2+内流和Ca2+释放没有作用(2006年)。　　 研究表明,在AS的发病过程中伴随着细胞内Ca2+浓度水平的变化,VDCC参与了巨噬细胞内Ca2+浓度变化的过程,VDCC的阻滞剂(氨氯地平等)对动脉粥样硬化具有一定的防治作用。在动脉粥样硬化的发病过程中,巨噬细胞的SOCC和ROCC有没有参与影响胞内Ca2+浓度的变化目前尚不清楚。三七人参皂甙Rd对动脉粥样硬化的发病过程有何影响,特别是对AS的重要病理生理基础——巨噬细胞泡沫化的影响如何也不清楚,都还有待深入研究。　　 综上所述,本研究拟分为体外实验和动物实验两大部分进行:(一)采用国际公认的己敲除apoE基因的小鼠,喂食高脂饲料制造AS动物模型,研究三七人参皂甙Rd对AS的预防和治疗作用；(二)以巨噬细胞来源的泡沫细胞为模型,研究三七人参皂甙Rd对巨噬细胞泡沫化过程的影响,并从细胞Ca2+运动的角度,研究三七人参皂甙Rd影响AS形成的作用机制。　　 第一部分三七人参皂甙Rd对巨噬细胞泡沫化的抑制作用及其机制1.巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立用终浓度为80μg/ml的OX-LDL处理巨噬细胞24、48小时,发现细胞内胆固醇含量显著增加(细胞内总胆固醇含量由77.8μg/mg蛋白分别增加到119.7μg/mg蛋白、169.9μg/mg蛋白,n=6,P<0.01),导致巨噬细胞明显泡沫化,成为泡沫细胞,泡沫细胞模型建立成功。　　 2.巨噬细胞泡沫化过程中Ca2+内流的变化实验采用Fura-2/AM荧光测定胞浆Ca2+浓度,观察巨噬细胞在泡沫化过程中细胞基础Ca2+水平,VDCC激动剂KCl、ROCC激动剂1-oleoyl-2-acetyl-sn-glyeerol(OAG)对Ca2+内流的影响和Ca2+池Ca2+泵抑制剂thapsigargin(TG)对Ca2+释放和Ca2+内流的影响；采用Fura-2/AM荧光Mn2+淬灭实验,观察巨噬细胞在泡沫化过程中OAG和TG引起的Fura-2/AM荧光淬灭率的变化,探讨钙通道在巨噬细胞泡沫化过程中的作用。　　 2.1在巨噬细胞泡沫化过程中经VDCC介导的Ca2+内流的变化在用OX-LDL处理48小时的巨噬细胞中,VDCC激动剂100mM KCl引起的净Ca2+内流为288.8±8.7 nM(n=6),而在未泡沫化的巨噬细胞中净Ca2+内流为184.9±16.8 nM(n=6,),两组间有显著性差异(P<0.01)。　　 结果说明在巨噬细胞泡沫化过程中经VDCC介导的Ca2+内流显著性增加。　　 2.2在巨噬细胞泡沫化过程中经SOCC介导的Ca2+内流的变化与未泡沫化的巨噬细胞组比较,在用OX-LDL处理6、12、24、48小时的细胞组中,Ca2+池Ca2+泵抑制剂TG所引起的净Ca2+释放没有显著性差异；TG所引起的Ca2+内流逐渐增加,12、24、48小时组均有显著性增加(n=6,P<0.05)。　　 与未泡沫化的巨噬细胞组比较,在用ox-LDL处理6、12、24、48小时的细胞组中,ca2+池Ca2+泵抑制剂TG所引起的Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率逐渐增加,12、24、48小时组均有显著性增加(n=6,P<0.05)。　　 结果说明在巨噬细胞泡沫化过程中经SOCC介导的Ca2+内流显著性增加。　　 2.3在巨噬细胞泡沫化过程中经ROCC介导的Ca2+内流的变化与未泡沫化的巨噬细胞组比较,在用ox-LDL处理6、12、24、48小时的细胞组中,OAG所引起的Ca2+内流逐渐增加,均有显著性差异(n=6,P<0.05)。　　 与未泡沫化的巨噬细胞组比较,在用ox-LDL处理6、12、24、48小时的细胞组中,OAG所引起的Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率逐渐增加,均有显著性差异(n=6,P<0.05)。　　 结果说明在巨噬细胞泡沫化过程中经ROCC介导的Ca2+内流显著性增加。　　 2.4相关性分析结果表明:　　 经SOCC介导的Ca2+内流与巨噬细胞泡沫化的严重程度呈正相关(r=0.866,n=90,P<0.01)。　　 经ROCC介导的Ca2+内流与巨噬细胞泡沫化的严重程度呈正相关(r=0.900,n=90,P<0.01)。　　 3.三七人参皂甙Rd对巨噬细胞泡沫化的抑制作用随着胞内胆固醇含量的增加,巨噬细胞泡沫化的程度逐渐加深,胞内胆固醇含量的变化,反映了巨噬细胞泡沫化的程度,因此,可以据此观察到三七人参皂甙Rd对巨噬细胞泡沫化的影响。　　 随着用ox-LDL处理巨噬细胞的时间(6、12、24、48小时)增加,在对照组、溶剂组、Rd1.25μM组、Rd2.5μM组、Rd5μM组、Rd10μM组、Rd20μM组和Rd40μM组(每组n=6)中,胞内胆固醇含量均逐渐增加。　　 用ox-LDL处理24dx时后,与对照组比较,Rd20μM组和Rd40μM组胞内胆固醇含量显著性减少,抑制率分别为19±2％、22.7±2.3％(n=6,P<0.05)；用ox-LDL处理48小时后,与对照组比较,Rd10μM组、Rd20μM组和Rd40μM组胞内胆固醇含量显著性减少,抑制率分别为25±2.2％、33.4±2％、38.4±2.5％(n=6,P<0.05)。　　 用ox-LDL处理的时间相同(24或48小时)时,则随着Rd的浓度增加,胞内胆固醇含量逐渐减少,Rd对泡沫化的抑制率逐渐增加。　　 4.三七人参皂甙Rd对巨噬细胞泡沫化过程中Ca2+内流的作用用终浓度为80μg/ml的ox—LDL处理巨噬细胞48小时,在对照组和Rd20μM组(每组n=6)中,采用Fura-2/AM荧光测定胞浆Ca2+浓度或Fura-2/AM荧光Mn2+淬灭实验,研究三七人参皂甙Rd对Ca2+内流的作用。　　 4.1在巨噬细胞泡沫化过程中,三七人参皂甙Rd对经VDCC介导的Ca2+内流的作用与对照组比较,在20μMM Rd组中100mM KCl诱导的胞外Ca2+内流没有显著性差异(n=6,P>0.05):在对照组和20μMM Rd组中,100mM KCl诱导的泡沫细胞Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率分别为50.9±4.7％和50.5±4.8％,两组间没有显著性差异(n=6,P>0.05)。说明在巨噬细胞泡沫化过程中三七人参皂甙Rd对经VDCC介导的Ca2+内流没有影响。　　 4.2在巨噬细胞泡沫化过程中,三七人参皂甙Rd对经SOCC介导的Ca2+内流的作用在对照组和20μM Rd组中,TG诱导的泡沫细胞Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率分别为40.2±4.1％和26.1±2.7％,两组间有显著性差异(n=6,P<0.05),说明在巨噬细胞泡沫化过程中三七人参皂甙Rd对经SOCC介导的Ca2+内流的有抑制作用。　　 4.3在巨噬细胞泡沫化过程中,三七人参皂甙Rd对经ROCC介导的Ca2+内流的作用在对照组和20μM Rd组中,OAG诱导的泡沫细胞Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率分别为30.6±2.9％和20.1±1.9％,两组间有显著性差异(n=6,P<0.05),说明在巨噬细胞泡沫化过程中三七人参皂甙Rd对经ROCC介导的Ca2+内流的有抑制作用。　　 小结　　 1.经VDCC、SOCC和ROCC介导的Ca2+内流均参与了巨噬细胞泡沫化的过程,而且经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流均与泡沫化的严重程度呈正相关。　　 2.三七人参皂甙Rd呈浓度依赖性和时间依赖性地抑制巨噬细胞泡沫化。　　 3.在巨噬细胞泡沫化过程中,三七人参皂甙Rd通过抑制经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流而抑制巨噬细胞的泡沫化,与经VDCC介导的Ca2+内流无关,说明三七人参皂甙Rd是SOCC和ROCC的特异性阻滞剂。　　 第二部分三七人参皂甙Rd对apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的防治作用及其机制1.动脉粥样硬化动物模型的建立选用apoE基因敲除小鼠,用高脂饲料喂养6周后,小鼠的主动脉已经有明显的动脉粥样硬化斑块形成(n=6,P<0.001,Compared with control group),表明已成功建立动脉粥样硬化的动物模型。　　 2.三七人参皂甙Rd对动脉粥样硬化的防治作用用高脂饲料喂养12周到实验结束时,在对照组、溶剂组、辛伐他汀组、三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组五组动物中,小鼠的主动脉都有明显的粥样硬化斑块,主动脉粥样硬化斑块的面积占内膜总面积的百分比分别为35.8±3.9％、26.6±5.9％、13.5±2％、7.3±1.4％、13.7±4.8％(n=10),三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组均显著低于对照组(P<0.01),且三七人参皂甙Rd预防组显著低于三七人参皂甙Rd治疗组(P<0.05)。　　 3.三七人参皂甙Rd对动脉粥样硬化防治作用的机制初探3.1三七人参皂甙Rd对小鼠血脂代谢的影响与对照组比较,三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组小鼠的血脂(TC,TG,LDL,HDL)水平均没有明显的差异(n=7,P>0.05)。实验结果表明,在动脉粥样硬化发病过程中,三七人参皂甙Rd对apoE基因敲除小鼠的血脂代谢没有明显影响。　　 3.2三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞经VDCC介导的Ca2+内流的影响在对照组、溶剂组、辛伐他汀组、三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的小鼠腹腔游离巨噬细胞中,加入KCl后Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率分别为51.3±4.7％、48.7±4.1％、36.8±3.9％、51.1±2.4％、52.6±4.4％(n=10)；与对照组比较,三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的最大荧光淬灭率均没有显著性差异(P>0.05)。　　 实验结果说明,在apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化发病过程中,三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞经VDCC介导的Ca2+内流没有明显的作用。　　 3.3三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞经SOCC介导的Ca2+内流的影响在对照组、溶剂组、辛伐他汀组、三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的小鼠腹腔游离巨噬细胞中,加入TG后Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率分别为45.4±4.1％、45.2±3.2％、42.8±4.5％、27.9±2.7％、32.3±3.3％(n=10):与对照组比较,三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的最大淬灭率明显降低,差异有显著性(P<0.05)。　　 实验结果说明,在apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化发病过程中,三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞经SOCC介导的Ca2+内流有明显的抑制作用。　　 3.4三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞经ROCC介导的Ca2+内流的影响在对照组、溶剂组、辛伐他汀组、三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的小鼠腹腔游离巨噬细胞中,加入OAG后Fura-2荧光Mn2+淬灭的最大淬灭率分别为34.3±3.1％、34.9±3.2％、31.1±2.6％、22.5±2.3％、24.4±2.1％(n=10):与对照组比较,三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的最大淬灭率明显降低,差异有显著性(P<0.05)。　　 实验结果说明,在apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化发病过程中,三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞经ROCC介导的Ca2+内流有明显的抑制作用。　　 3.5三七人参皂甙Rd对小鼠腹腔游离巨噬细胞摄取胆固醇能力的影响将从小鼠腹腔提取的游离巨噬细胞用标记了Dil荧光的ox-LDL处理后,用激光扫描共聚焦显微镜检测荧光强度,荧光强度代表了细胞摄取的ox—LDL量的大小。在对照组、溶剂组、辛伐他汀组、三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的小鼠腹腔游离巨噬细胞中,三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组的平均荧光强度均明显低于对照组(n=10,P<0.05),表明三七人参皂甙Rd预防组和三七人参皂甙Rd治疗组细胞摄取的ox—LDL,的量均明显少于对照组。　　 实验结果说明,在apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化发病过程中,三七人参皂甙Rd明显抑制小鼠腹腔游离巨噬细胞摄取胆固醇的能力。　　 小结　　 1.预防性和治疗性地给予三七人参皂甙Rd,均可以减少apoE基因敲除小鼠动物模型的主动脉粥样硬化斑块的面积,表明三七人参皂甙Rd具有防治动脉粥样硬化的作用。　　 2.在apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化发病过程中,三七人参皂甙Rd对血脂代谢没有明显影响；明显抑制腹腔游离巨噬细胞摄取胆固醇的能力；明显抑制腹腔游离巨噬细胞经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流,而对经VDCC介导的Ca2+内流没有作用。结果表明三七人参皂甙Rd通过抑制经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流而减少巨噬细胞对胆固醇的摄取从而防治动脉粥样硬化。　　 结论　　 1.经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流参与了巨噬细胞泡沫化的进程且与泡沫化的严重程度呈正相关。　　 2.三七人参皂甙Rd呈浓度依赖性和时间依赖性地抑制巨噬细胞泡沫化。　　 3.三七人参皂甙Rd并非通过影响血脂代谢,而是通过特异性地抑制经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流而抑制巨噬细胞泡沫化从而防治动脉粥样硬化。　　 创新与意义　　 1.首次证实了三七人参皂甙Rd呈浓度依赖性和时间依赖性地抑制巨噬细胞泡沫化,为防治动脉粥样硬化提供了新的候选药物。　　 2.首次证实了经SOCC和ROCC介导的Ca2+内流参与了巨噬细胞泡沫化的进程,且与泡沫化的严重程度呈正相关,为防治动脉粥样硬化提供了新的靶点。　　 3.首次证实了三七人参皂甙Rd并非通过影响血脂代谢,而是通过特异性地抑制经ROCC和SOCC介导的Ca2+内流而抑制巨噬细胞对胆固醇的摄取,进而抑制了巨噬细胞泡沫化。从Ca2+运动的角度解释了三七人参皂甙Rd防治动脉粥样硬化的机制。