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研究背景中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV）是已知的第六种感染人类的冠状病毒,因其高致死率和持续小规模感染事件,严重威胁着人类健康。随着COVID-19在当今全世界的大规模流行,冠状病毒已引起众多研究者的高度关注,然而对于目前已知的能够感染人类的冠状病毒,我们对其致病机理尚未有全方面的认识。MERS-CoV以单股正链RNA为遗传物质,基因组全长约30.1kb,由11个开放阅读区（open reading fragment）组成,从基因组5’端起编码复制酶多聚蛋白ppla和pplab、多个辅助蛋白及结构蛋白。复制酶多聚蛋白pplab经过蛋白酶剪切后产生16个非结构蛋白（Nonstructural protein,nsp）nspl-nsp16,研究表明,非结构蛋白在病毒复制和拮抗宿主天然免疫反应中有重要作用。细胞凋亡是已知细胞死亡方式中研究较清晰的一种,在病毒感染过程中通常伴随着细胞凋亡的发生。在病毒入侵宿主细胞时,受感染的细胞发生细胞凋亡会限制病毒的复制,感染早期阶段抑制宿主细胞凋亡则能够增加病毒复制的能力。多篇文章报道了冠状病毒蛋白和细胞凋亡的相关研究,研究者们认为MERS-CoV能够引起肺或肾细胞凋亡可能是导致患者器官衰竭的重要原因。因此,筛选并深入探究MERS-CoV中非结构蛋白对细胞凋亡的影响,不仅有利于我们对其致病性的理解,也能为抗病毒药物靶点的选择提供理论基础和实验依据。研究目的1.筛选对肺细胞凋亡有调控作用的MERS-CoV nsp;2.探究MERS-CoV nsp影响细胞凋亡的机制以及对病毒复制的影响;3.为防治MERS-CoV提供新的靶点。研究方法1.在293T细胞中通过磷酸钙转染法进行慢病毒包装,收集上清慢病毒液,感染到A549细胞,48h后再荧光显微镜下观察慢病毒感染细胞效率;2.通过无血清培养基培养诱导细胞凋亡,利用JC-1及Mito-Tracker线粒体膜电位染料,通过流式细胞术、荧光显微镜及Western Blot确定无血清培养诱导肺细胞凋亡模型的建立;3.在完全培养基及无血清培养基培养12h及24h条件下,流式细胞术检测nsP14对A549细胞凋亡的影响,WesternBlot检测AKT/mTOR、p65、Caspase-3及Caspase-8的活化,流式细胞术检测nsp对A549细胞周期;4.使用内源性凋亡诱导剂ABT-737处理293T细胞,通过流式细胞术检测nsp14对293T细胞凋亡影响,利用定量PCR及Western Blot检测凋亡相关分子变化;5.定量PCR检测nsp14对细胞凋亡相关分子BAX、SMAD7、APAF-1、BCL-2、BCL2L2及HSP701A的影响,Western Blot检测nsp14对凋亡相关蛋白BAX、BCL2L1、BCL2L2、BCL-2 的影响;6.在无血清培养基培养细胞的模型下,使用线粒体膜电位指示剂Mito-Tracker,通过流式细胞术及共聚焦显微镜检测nsp14对A549细胞线粒体膜电位的影响,使用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测nsp14对A549细胞线粒体呼吸的影响;7.利用PCDH载体构建p53-HA过表达质粒,293T细胞中检测外源性转染的p53与nsp14的相互作用;8.利用PCDH载体构建BAX过表达质粒,向nsp14感染的A549回转BAX,使用线粒体膜电位指示剂Mito-Tracker,流式检测线粒体膜电位;9.利用pcDNA3.1载体上构建nsp14-GFP及nspl-His过表达质粒;10.向293T细胞转染nsp14-His质粒和细胞器marker-荧光融合质粒,利用共聚焦显微镜观察nsp 14亚细胞定位情况以及和多种细胞器共定位情况;11.电子显微镜拍摄VSV感染引起293T细胞的形态学变化,CCK8检测VSV感染后12h和24h时间点nsp14对293T细胞增殖的影响,定量PCR检测VSV感染后nsp14对病毒复制的影响,流式细胞术检测VSV感染293T细胞12h后nsp 14对线粒体膜电位的影响。研究结果1.nsp表达载体的构建与鉴定我们利用慢病毒载体PCDH构建了 MERS-CoV nsp表达质粒。通过荧光显微镜观察结果显示,细胞转染效率较高。收取慢病毒病,使用收取的慢病毒液感染A549细胞48h后进行拍摄,结果显示A549细胞感染效率较高。2.无血清培养基诱导细胞凋亡的模型我们使用无血清培养基培养诱导肺细胞凋亡为模型。JC-1染色后使用荧光显微镜及流式细胞术检测到H460细胞发生凋亡,线粒体膜电位降低。线粒体膜电位指示剂Mito-Tracker染色,流式结果表明无血清诱导A549细胞线粒体膜电位降低。同时,Western Blot结果表明无血清培养基诱导细胞外源性凋亡分子Caspase8的活化。3.nsp14 抑制 Caspase3 活化使用无血清培养基培养细胞12h后,我们筛选到nsp 14能够抑制A549细胞的早期凋亡和晚期凋亡,但是对A549细胞周期无明显影响。Western Blot结果显示nsp14对NF-κB以及AKT/mTOR信号通路无明显影响。nsp14能够抑制无血清细胞培养基诱导的Cleaved-Caspase3表达,但是对Pro-Caspase3、Pro-Caspase8 及 Cleaved-Caspase8 的表达无明显影响。4.nsp14抑制内源性凋亡诱导剂诱导的细胞凋亡流式细胞术结果表明,nsp14抑制ABT-737诱导的细胞内源性凋亡。定量PCR及Western Blot结果表明,nsp14抑制293T细胞BAX的表达。5.nsp14调控A549凋亡相关分子的表达定量PCR结果显示,相比于对照组,nsp14抑制促凋亡分子BAX、SMAD7及APAF-1的mRNA表达,并且促进抑制凋亡分子BCL-2、BCL2L2及HSP701A的mRNA表达。Western Blot结果显示,nsp14显著抑制BAX表达,促进BCL-2表达,并且对BCL-W、BCL-xl等分子无明显影响。6.nsp14通过维持线粒体膜电位抑制细胞凋亡我们使用线粒体膜电位指示剂对无血清培养基培养的A549细胞染色后观察其膜电位变化,流式细胞术及聚焦显微镜结果显示,nsp14组线粒体膜电位高于对照组。由于细胞线粒体膜电位降低会损伤线粒体功能,我们对细胞线粒体压力进行了检测。Seahorse结果显示,在无血清培养基培养A549细胞时,nsp14组的线粒体呼吸能力、ATP生成能力、最大呼吸值及备用呼吸能力等指标均显著高于对照组。7.nsp14与p53相互作用我们利用PCDH载体构建了 p53-HA过表达质粒,在293T细胞中过表达外源性p53-HA及nsp14,IP结果表明p53与nsp14存在相互作用。8.BAX过表达可以削弱nsp14抑制细胞凋亡的作用我们利用PCDH载体构建了 BAX过表达质粒,通过BAX慢病毒感染稳定表达nsp14的A549细胞,流式细胞术检测线粒体膜电位变化,结果表明过表达BAX消除了 nsp14对线粒体膜电位的维持能力。9.nsp14-GFP及nsp14-His融合蛋白过表达载体构建为了进一步探究nsp14抑制细胞凋亡功能的机制,我们利用pcDNA3.1载体构建了 nsp14-GFP及nsp14-His融合质粒。10.nsp14的亚细胞定位向293T细胞中转染了 nsp14-His及细胞器Marker荧光质粒后,共聚焦显微镜结果显示,nsp14以点状形式分布于细胞浆中,不存在于细胞核中,并且与线粒体、高尔基体、溶酶体及晚期内体均无共定位。11.nsp14维持293T细胞活力并促进VSV复制我们使用能够诱导细胞内源性凋亡的VSV感染表达nsp14的293T细胞后,CCK8结果表明,VSV感染后,12h时nsp14组细胞活力高于对照组,24h时nsp14组细胞活力低于对照组,定量PCR结果表明,VSV感染12h及24h时,nsp14组病毒基因组表达高于对照组。流式细胞术结果显示,VSV感染293T细胞12h时,nsp14组线粒体膜电位明显高于对照组。结论及意义1.本研究发现MERS-CoV非结构蛋白nsp14能够抑制肺细胞凋亡,提示nsp14在病毒感染早期阶段通过维持宿主细胞活力从而有利于病毒的复制;2.nsp14通过维持线粒体膜电位,抑制细胞内源性细胞凋亡;3.nsp14是防治MERS-CoV候选药物的潜在靶点。