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犬瘟热(Canine distemper, CD)病的病原是犬瘟热病毒(Canine distemper virus CDV)，该病以双相热、急性鼻卡他、结膜炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征。发病率和死亡率较高，给养犬业和毛皮动物饲养业带来极大的危害，加强本病的预防免疫极为重要，因此采用重组DNA技术生产基因工程亚单位疫苗无疑有重要意义。本文成功实现了犬瘟热病毒f、h基因在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达，为构建新型基因工程亚单位疫苗奠定基础。
本研究根据GenBank中已发表犬瘟热病毒Onderstepoort株设计引物，以犬瘟热病毒Lederle株感染Vero细胞收获病毒悬液为模板，经RT-PCR扩增出f基因约2.0kb和h基因约1.8kb两个片段，按常规方法克隆到pGEM-T Easy载体，经蓝白斑筛选和酶切分析获得阳性重组质粒，并进一步对两片段进行序列分析。结果表明:f基因的开放阅读框架(ORF)为1989bp，h开放阅读框架(ORE)为1824bp。序列测定分析表明该株f基因与疫苗株Onderstepoort、CDV3核苷酸同源性分别为分别为:95.8％、98.9％，编码氨基酸同源性分别为:92.5％、97.3％;与美国分离株A75-17核苷酸同源性为91.5％，编码氨基酸同源性为88.4％;与中国分离株BS0610、GN、HL、SC01、NM、ZD01核苷酸同源性分别为分别为:90.1％、90.3％、91.4％、90.3％、90.8％、89.8％，核苷酸同源性分别为分别为:87％、87.3％、89.2％、87.5％、87.3％、86.4％;该株h基因与疫苗株Onderstepoort、Convac、CDV3核苷酸同源性分别为:96.4％、97.1％、99.6％，编码氨基酸同源性分别为:94.9％、95.9％、98.9％;与中国分离株JL(08)2、Liud、SD(08)1核苷酸同源性分别为分别为:91.2％、92％、91.3％，编码氨基酸同源性分别为:91.6％、91.6％、91.8％;与美国分离株A92-6、A92-27/4、98-2646、01-2689、A75-17核苷酸同源性分别为:92.3％、91.9％、98.1％、90.7％、92.5％，编码氨基酸同源性分别为:92.4％、92.1％、97％、90.1％、93.1％;与日本分离株Ueno、Yanaka核苷酸同源性分别为:91.6％、91.5％，编码氨基酸同源性分别为:92％、91.8％。
以pGEM-T-CDV-F和pGEM-T-CDV-H为模板，分别设计了一对扩增CDV的f基因和h基因主要抗原区特异性引物，在引物的上下游分别带有EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位点。通过PCR扩增获得目的片段后回收，用相同的限制性内切酶酶切表达载体pPICZαA后构建重组表达载体pPICZαA-CDV-F和pPICZαA-CDV-H，并转入E.coliDH5α中，得到基因工程菌，经酶切和测序鉴定证明克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为犬瘟热病毒的f和h基因。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA-CDV-F和pPICZαA-CDV-H质粒转化到巴斯德毕赤酵母X-33中，经筛选、PCR鉴定，获得含有犬瘟热病毒f和h蛋白基因的重组酵母菌株，用0.5％甲醇诱导目的蛋白表达。进行表达产物的SDS-PAGE鉴定，可产生相对分子量约为39KDa和18KDa的表达产物，表明成功地建立了含CDV的F、H蛋白的重组酵母表达系统。表达产物的Western-blot鉴定证明了表达的F和H蛋白具有反应原性。