论文部分内容阅读
乳铁蛋白N端是生物功能活跃的区域。乳铁蛋白肽(LFcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多肽，广泛存在于动物的乳汁、体液、泪液、唾液、血浆、中性粒细胞及多种组织中。具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、调节机体免疫、促进骨细胞生长等多种生物功能，在众多的功能中，抗菌功能是最引人注目的，具有很好的应用前景。天然牛乳铁蛋白(bLF)是目前牛乳铁蛋白肽(bLFcin)的主要来源。由于天然的牛乳铁蛋白及其多肽来源有限、成本较高，因此通过基因工程的方法，利用大肠杆菌细胞生产重组牛乳铁蛋白多肽，既可以解决牛乳铁蛋白多肽来源稀少，又可以降低成本、提高效率、创造很大的经济利益。
选用牛肝脏为原料提取细胞总DNA，以此为模板，根据GenBank中已发表的bLF基因的cDNA序列，设计合成特异引物，经PCR扩增bLF外显子2，构成重组牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)编码基因。经DNA序列分析证明与GenBank中cDNA序列162bp完全一致。通过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶酶切，将rbLF-N重组基因插入到大肠杆菌(E.coli)表达质粒pGEX-4T1中，构建重组表达质粒pGEX-4T1/rbLF-N，并转化E.coliBL21大肠杆菌菌株，经抗性筛选、IPTG诱导表达，获得重组牛乳铁蛋白氨基末端多肽-GST融合蛋白重组大肠杆菌转化子BL21/rbLF-N，成功获得表达的重组菌株，其rbLF-N-GST融合蛋白表达量达到20.4％，产率为1.68g/L。重组菌株表达的融合蛋白以包含体存在，经过复性研究，确定了最佳的复性条件是：pH值为8.5，蛋白溶液浓度为100μg/mL和DTT浓度为24mmol/L时，包含体rbLF-N-GST融合蛋白的复性率最高。复性后通过亲和层析柱分离纯化，并经凝血酶酶解去除GST标签，获得rbLF-N，经HPLC分析，其纯度达到93.23％，重组多肽氨基酸序列通过LC-MSMS二级质谱鉴定。
rbLF-N经胃蛋白酶酶解后，用于G+菌和G-菌的抗菌活性检测，证明具有抗菌活性，抗菌效果比文献报道的化学合成的牛乳铁蛋白肽的活性高。对病原菌S.Aureus，S.mutans，E.coli和K.pneumoniae的MIC和MBC分别为1.85，1.85，1.85，3.70μmol/L和3.73，1.85，1.85，7.40μmol/L。表明采用重组表达的牛乳铁蛋白N端多肽rbLF-N经胃蛋白酶酶解后，表现出天然的bLFcin生物活性。将获得的具有生物活性的抗菌肽用于生猪肉的抗菌保鲜试验，以Nisin、乳酸为参照，试验结果表明用1％的重组肽对生猪肉浸沾后，真空包装贮藏在4℃条件下，可以保存19d。其保鲜效果优于Nisin，与乳酸接近。
本研究首次建立了牛乳铁蛋白N端多肽的重组表达体系，为进一步研究牛乳铁蛋白多肽与其功能的关系奠定了有力的基础；为重组牛乳铁蛋白多肽的应用开发以及工业化生产提供了可行的依据。