研究背景： 内皮功能状态是动态的平衡。一方面内皮层不断接触来自周围微环境及循环中的有害因素导致内皮受损。内皮微颗粒生成增加是内皮细胞受到激惹或者凋亡因素刺激时的特异反应，是内皮急性和慢性损伤的敏感指标。另一方面，内皮层本身具备修复能力。目前认为损伤内皮的修复主要依靠循环中具备潜在内皮分化倾向的一群细胞募集到损伤处后分化增值修补空缺的区域。大量实验资料表明，骨髓、外周血和脐血中存在能分化为内皮细胞并参与血管修复的EPC。这群细胞已报道在内皮损伤情况下募集到损伤部位增殖分化为内皮细胞修补空缺，是内皮最大的修复种子细胞库。上述研究表明内皮祖细胞可以作为心血管疾病细胞疗法的种子细胞。然而，心血管系统的危险因素，如吸烟、高血压、高血脂、高血糖等可以损伤EPCs的功能，并加速外周循环中EPCs的凋亡，使外周循环中的EPCs处于低功能状态。循环中的内皮祖细胞在许多心血管疾病状态或危险因素存在情况下数量和功能受到削弱，进一步促进了内皮功能障碍的发生发展。我们研究小组曾发现在增龄人口循环内皮祖细胞与传统评估内皮功能所用的血流介导的血管舒张反应存在高度相关关系，认为增加内皮祖细胞的数量和改善其功能可作为以内皮为靶点的细胞治疗策略之一。其他研究组也曾报道过，在高脂血症的人群，循环内皮微颗粒和内皮祖细胞的比值可作为内皮损伤修复的参考，与传统方法血流介导的血管舒张反应相结合，进以评估内皮损伤的程度。在临床运用前景上，寻找有效减少内皮微颗粒水平调动内皮祖细胞对于防治心血管疾病有重要意义。 黄连素是一种传统的中草药其成分单一、价格低廉，具有抗菌、抗肿瘤和止泻等作用。近年来发现黄连素具有重要的心血管系统的保护作用.黄连素可以抑制血管平滑肌的增殖同时具有明显的抑制血小板的功能；黄连素具有不同于他汀类药物调脂机制的调脂作用，具有多途径、多靶点的心血管保护作用。黄连素可以增加内皮细胞产生NO；黄连素与动脉条共浴可以增加动脉条对乙酰胆碱的舒张反映，这种作用可以被eNOS的抑制L—NAME阻断，同时加入L—精氨酸可以使黄连素诱导的内皮舒张功能恢复；说明黄连素改善动脉内皮细胞依赖的舒张功能，可能与其上调eNOS表达或者增加eNOS活性有关。黄连素队内皮微颗粒的作用及其与内皮祖细胞的关系以往未见报道。若黄连素可以作为内皮祖细胞的中药调动剂，同时降低内皮微颗粒水平，那么黄连素的心血管保护作用可以叠加从而使心血管疾病得到更有效的防治。 在国内建立了内皮微颗粒分离鉴定的检测方法，并开展了一系列基础和临床研究，包括内皮微颗粒与炎性介质的关系，与动脉弹性的关系，并进一步探讨内皮微颗粒的损伤血管内皮功能的分子机制探讨。假设内皮微颗粒导致超氧阴离子自由基产生增加可能与内皮微颗粒促使BH4缺乏致eNOS脱偶联有关，同时检测了循环内皮微颗粒，内皮祖细胞及其集落形成单位的数目，内皮依赖的血管舒张功能以及主动脉脉搏波传导速度，观察内皮损伤与修复在维持内皮功能的作用及其在动脉硬化中扮演的角色。为了进一步探讨内皮微颗粒与整体动脉损伤的关系，我们招募健康志愿者检测其体内循环内皮微颗粒水平同时检测大小动脉弹性水平以观察两者之间在体内的联系，并且在部分健康志愿者进行黄连素口服干预治疗，以观察内皮损伤和内皮功能的关系。可以预见的是，内皮微颗粒与内皮祖细胞作为内皮层损伤修复的指标与动脉弹性相关研究的逐渐深入将会为血管疾病的发病和防治提供新的思路和对策。 目的： 1.C—反应蛋白诱导人脐静脉内皮细胞生成内皮微颗粒减少NO生成的实验及其相关机制的研究。2.黄连素对SHR大鼠内皮微颗粒和内皮祖细胞及动脉弹的影响性的体内试验。3.健康志愿者体内循环内皮微颗粒与动脉弹性功能的的研究。4.黄连素保护健康人群内皮功能的机制研究。 方法： 1.体外实验以CRP刺激人脐静脉内皮细胞24小时，扫描电镜观察内皮微颗粒的生成。应用流式细胞仪检测细胞培养液中CD31和CD51阳性微颗粒的水平，同时检测细胞培养液中一氧化氮代谢产物水平。在部分试验中添加外源性四氢生物喋呤或者BH4合成抑制剂DAHP，以观察BH4在CRP诱导内皮微颗粒生成中的作用。 2.给予4周大雄性SHR大鼠黄连素治疗，用年龄性别匹配的SHR或WKY大鼠予生理盐水作为对照。在治疗后检测各组循环内皮微颗粒水平及各项生化指数的变化。抽取外周血体外诱导单个核细胞分化为内皮祖细胞，检测其数目和集落形成单位的变化。同时，检测主动脉脉搏波传导速度及动脉环实验。比较各组数据的变化。将生理盐水组SHR和WKY大鼠数据结合，做内皮功能指标之间及它们与大动脉硬化指标主动脉脉搏波传导速度之间的相关分析。 3.采用病例对照研究的方法，召集年龄45-60岁的健康志愿者76人，抽取空腹静脉血，经两步低温离心后利用流式细胞仪进行循环内皮微颗粒水平检测。同时采用自动的容量体积描记仪器动脉检测仪VP-1000(测定踝肱脉搏波传导速度，以及CVProfilor DO—2020Cardio Vasuclar System测定大动脉弹性指数C1和小动脉弹性指数C2。评价内皮微颗粒与动脉弹性指标baPWV，C1和C2之间的关系。 4.召集年龄42～63岁健康志愿者25人，随机进入服药组和对照组，进行为期1个月的黄连素口服治疗。治疗前后检测其循环内皮微颗粒及血流介导的血管舒张反应的变化。为证明高内皮微颗粒水平下黄连素对内皮层的直接保护作用，在体外用原代培养的脐静脉内皮细胞作为细胞模型，体外用106/mL的内皮微颗粒刺激下加或不加黄连素预处理，用流式细胞仪检测内皮细胞内内皮型一氧化氮合酶的表达和细胞内活性氧的变化。 结果： 1.扫描电镜观察见静息状态下的HUVECs呈鹅卵石样贴壁生长，表面生成小泡较少。CRP刺激后的HUVECs呈出疹样表面，小泡数量显著增加，几乎覆盖细胞表面。高倍视野下显示这些泡的直径约1.0μm左右。流式细胞仪检测结果显示HUVECs生成的微颗粒CD31及CD51表达阳性。CRP刺激组内皮微颗粒水平显著高于正常对照组。在CRP刺激的同时外源性添加BH4可以有效减少EMP的生成，而CRP刺激的同时添加BH4合成抑制剂DHAP进一步促进EMP的生成。 2.在自发性高血压大鼠循环内皮微颗粒水平较血压正常鼠明显升高，体外诱导分化的内皮祖细胞数目减少，集落形成单位减少，内皮依赖的血管舒张功能降低，而主动脉脉搏波传导速度明显加快。给高血压大鼠予黄连素治疗后，与给与生理盐水的高血压大鼠相比，循环内皮微颗粒水平显著下降，内皮祖细胞数目显著增加但末恢复到血压正常鼠的水平，集落形成单位数目也显著增加，恢复到血压正常鼠水平。内皮依赖的血管舒张功能显著改善，但未恢复到血压正常鼠的水平。主动脉脉搏波传导速度明是减慢，仍高于血压正常鼠的水平。在给予黄连素治疗的同时，给与L—NAME处理，黄连素的内皮保护作用如降低循环内皮微颗粒，增加内皮祖细胞及其集落形成单位数量，改善内皮依赖的血管舒张功能皆被显著抑制，然而黄连素对主动脉弹性的保护则未见明显改变。将血压正常鼠和生理盐水组高血压大鼠的数据合并做相关分析发现，循环内皮微颗粒和内皮祖细胞水平呈显著负相关，与内皮祖细胞集落形成单位数量呈显著负相关，与内皮依赖的血管舒张功能呈显著负相关。内皮祖细胞及其集落形成单位数量与内皮依赖的血管舒张功能呈显著正相关。同时，循环内皮微颗粒与内皮祖细胞的比值与主动脉脉搏波传导速度呈显著正相关。 3.在健康人群循环中取得的数据中，将内皮微颗粒进入相关及回归前进行Log转换，Log—EMPs与收缩压，舒张压，脉压，平均动脉压，BaPWV呈正相关，与C1，C2呈负相关，而与血脂，血糖关系不显著。baPWV，C1和C2本身与年龄和血压水平存在相关关系。循环内皮微颗粒水平分别与baPWV呈正相关，与C1和C2呈负相关。分别以BaPWV，C1和C2为因变量，上述单因素相关的自变量进行多因素回归分析显示，内皮微颗粒是仅次于收缩压、年龄的动脉弹性变化的独立相关因素。 4.在健康人群做前瞻性研究，与对照组相比黄连素组的循环内皮微颗粒水平在治疗后显著降低，血流介导的血管舒张反应改善而硝普钠介导的血管舒张反应无显著改变。循环内皮微颗粒水平和血流介导的血管舒张反应之问的存在高度负相关关系。在体外实验中，高水平的内皮微颗粒刺激后内皮细胞内eNOS表达下降而活性氧生成增加。而加黄连素预处理后，内皮细胞内eNOS表达升高而活性氧生成降低。 结论： 1.内皮微颗粒可作为评估内皮损伤新的替代指标；C反应蛋白在体外能促进EMP的生成，导致内皮功能障碍，此作用与BH4依赖的NO有关。 2.高血压状态下内皮损伤增加，表现为循环内皮微颗粒水平升高，而内皮修复能力下降，表现为内皮祖细胞及其集落形成单位减少，内皮依赖的血管舒张功能受损。循环内皮微颗粒和内皮祖细胞的比值是反映内皮功能的敏感指标。高血压性的动脉硬化与内皮损伤和修复紧密相联。黄连素能有效减少循环内皮微颗粒水平，增加内皮祖细胞数目及其集落形成单位数目，改善内皮依赖的血管舒张反应，使大动脉硬化程度减低。黄连素对内皮的保护是部分通过eNOS其作用的。 3.健康志愿者体内内皮微颗粒水平和动脉弹性呈显著相关，内皮微颗粒水平越高，大小动脉弹性越差。内皮微颗粒检测可作为临床评估动脉损伤的生化指标之一。 4.在健康人群黄连素能显著降低循环内皮微颗粒水平，改善内皮依赖的血管舒张功能，它对内皮的保护是部分的通过增加内皮内eNOS的表达和减少细胞内活性氧的生成起作用的。