研究背景肺癌是发病率最高的肿瘤,也是全球肿瘤相关死亡的主要原因之一,现已成为严重威胁人们生命健康的恶性疾病。肺癌主要分非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),分别占所有肺癌的80-85%和15-20%。其中,非小细胞肺癌中最常见的类型是腺癌,约占非小细胞肺癌的55%,在亚裔非吸烟的患者中这一比例会更高。由于早期症状隐匿且无特异性,很多病人确诊时已届晚期。随着肺癌的治疗理念不断更新,新的靶向治疗药物层出不穷,晚期肺癌可选择的治疗药物不断丰富,但遗憾的是,晚期肺癌患者的5年生存率仍仅为10-15%,其主要原因是无论何种药物后期均会产生耐药性,导致临床上缺乏持久有效的治疗手段。因此,寻找新的肺腺癌早期诊断标记物及治疗靶点具有重要意义。microRNA(miRNA)是近年来发现的一类小的内源性核糖核酸,由18-24个核苷酸组成,属于非编码RNA家族的成员,迄今为止,在人类基因组中发现了大约2000种miRNA(http://www.mirbase.org)。作为编码基因转录后水平的主要调控因子,其通过与靶基因mRNA3’-非翻译区互补配对结合,导致靶基因的功能失调。miRNA异常表达导致肿瘤细胞多个功能程序紊乱,包括增殖,迁移、侵袭耐药及复发等。因此,miRNA被认为是多种肿瘤潜在的生物标记物,例如miR-122在肝癌中表达明显下降,而miR-221、miR-222和miR-21在肝细胞癌(HCC)中过表达。另外miR-125b和miR-145作为肿瘤抑制因子在肿瘤中表达显著下调,而 miR-21,miR-155,miR-24、miR-125b、miR-21、miR-19 和 miR-155则是重要的促癌miRNA,在肿瘤中过度表达。作为第一个编号的miRNA,miR-1-3p与多种人类疾病相关,特别是以在骨骼肌和心肌组织中的调节作用而闻名,包括肌细胞生成,肌肉增殖和分化。目前研究表明miR-1-3p在多种肿瘤类型中发挥作用,包括横纹肌肉瘤以及甲状腺,前列腺,膀胱,结肠直肠,和肝脏肿瘤等。然而,miR-1-3p在肺腺癌中如何调节肿瘤增殖、迁移和细胞凋亡等生物学功能,与哪些靶基因结合及下游作用机制尚未得到系统研究。探讨miR-1-3p与下游靶基因的作用及相关信号通路可以加深对肺腺癌发展的分子机制的理解,从而促进肺腺癌改良疗法的发现。因此,本课题主要致力于研究 miR-1-3p在肺腺癌发生发展中作用以及具体调控机制,研究内容分为以下三部分。一.miR-1-3p在肺腺癌中的表达、生物学功能及临床意义研究二.miR-1-3p下游关键靶基因筛选鉴定、靶基因功能及临床信息研究三.PRC1在肺腺癌下游分子调控机制筛选及验证研究第一部分miR-1-3p在肺腺癌中的表达、生物学功能及临床意义研究研究目的miR-1-3p是与肿瘤发生和发展相关的最重要的miRNA之一,其异常表达已在其他类型肿瘤(如卵巢癌,前列腺癌等)中检测到,并广泛参与肿瘤的增殖,迁移,浸润和血管生成等过程。但在肺腺癌中,尚未明确其功能及临床意义。本部分旨在研究miR-1-3p在肺腺癌中的表达、临床意义及生物学功能研究。研究内容和方法收集新鲜肺腺癌及癌旁正常组织手术标本,应用qRT-PCR检测miR-1-3p在上述组织中的表达量。同时应用qRT-PCR检测miR-1-3p在肺腺癌细胞(A549,H1299和H1975细胞)和正常肺泡上皮细胞(HPAEPIC细胞)中的差异表达。使用miR-1-3p mimics瞬时转染肺腺癌细胞(A549,H1299和H1975细胞),应用qRT-PCR确认转染效率,建立miR-1-3p过表达细胞系。利用miR-1-3p过表达的肺腺癌细胞系(A549,H1299和H1975细胞),应用MTT检测miR-1-3p对肺腺癌癌细胞的增殖影响,使用Transwell检测细胞侵袭和转移情况,并利用Western blot检测相关蛋白的表达变化。构建miR-1-3p过表达质粒并稳定转染肺腺癌细胞系(A549,H1299和H1975细胞),实施裸鼠皮下成瘤试验,研究miR-1-3p对肿瘤生长的影响。根据所收集的肺腺癌病理组织的患者信息,追踪患者肿瘤相关临床资料(包括肿瘤大小、TNM分期、周围淋巴结及远处转移情况等),结合miR-1-3p表达水平,分析miR-1-3p的临床意义。研究结果应用qRT-PCR技术分别检测肺腺癌组织及细胞与正常对照组中的miR-1-3p表达水平。结果显示,肺腺癌组织中miR-1-3p的表达水平明显低于正常肺组织中miR-1-3p表达水平。同样,与正常肺泡上皮细胞(HPAEPIC)相比,在人类肺腺癌细胞系A549、H1299和H1975中也观察到miR-1-3p表达显著下调。以上结果表明,miR-1-3p异常表达可能参与肺腺癌的生理过程miR-1-3p mimic瞬时转染导致肺腺癌细胞(A549,H1299和H1975细胞)miR-1-3p表达显著增加。通过MTT试验检测上述细胞与未转染肿瘤细胞的增殖速度差异,结果发现,过表达的miR-1-3p以时间依赖性的方式显著抑制了这三种肺腺癌细胞系的增殖。这些结果提示,miR-1-3p足以在体外抑制肺腺癌细胞的生长。为了进一步研究miR-1-3p对肺腺癌的侵袭和转移方面的影响,我们对miR-1-3p过表达细胞株(A549,H1299和H1975细胞)及正常肺泡上皮细胞(HPAEP1C细胞)使用Transwell法检测。结果显示,肺腺癌细胞miR-1-3p过表达后,其侵袭及转移能力较正常肺泡上皮细胞明显下降。同时应用Western-blot检测上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中标志性蛋白(fibronectin、N-cadherin 和 vimentin)的差异表达,结果表明,在 miR-1-3p 过表达的细胞株中,以上3种蛋白表达水平均降低。这些数据证明,miR-1-3p通过抑制fibronectin、N-cadherin和vimentin的表达,降低肺腺癌细胞的侵袭和转移能力,从而抑制肺腺癌的进展。除体外实验外,我们将miR-1-3p过表达及对照的肺腺癌A549细胞接种于裸鼠皮下。接种3周后,miR-1-3p过表达荷瘤小鼠与对照组相比,肿瘤大小和重量均显著下降。以上结果表明,miR-1-3p的过表达抑制小鼠体内肿瘤生长。通过分析肺腺癌病理标本中miR-1-3p的表达量与患者的肿瘤大小、分期、周围淋巴结及远处转移等信息的相关性发现,低水平的miR-1-3p与TNM分期、淋巴结转移和远处转移密切相关。这些数据表明肺腺癌的发展可能与miR-1-3p低表达有关。研究结论miR-1-3p在肺腺癌组织和细胞系中低表达,miR-1-3p过表达显著抑制肺腺癌细胞系的增殖,并通过抑制fibronectin、N-cadherin和vimentin的表达,降低肺腺癌细胞的侵袭和转移能力。在体内,肺腺癌细胞miR-1-3p过表达显著抑制小鼠体内肿瘤的生长。在临床上,miR-1-3p低表达的患者肿瘤进展快,转移早。第二部分miR-1-3p下游关键靶基因筛选鉴定、靶基因功能及临床信息研究研究目的目前已知miR-1-3p参与肺腺癌的增殖、转移等生物学过程,其高表达显著抑制肺腺癌的发生和发展。miR-1-3p发挥作用的主要方式是与下游靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)结合,通过抑制基因翻译过程导致下游靶基因功能失调,对下游基因实现转录后调控。但miR-1-3p作用于哪种靶基因尚不明确。本部分研究旨在通过相关数据库预测miR-1-3p潜在下游靶基因,并筛选出相关性较强的基因加以鉴定,探讨该靶基因在肺腺癌中的功能,分析其表达水平与患者相关临床信息的关系。研究内容和方法利用starbase网站中(http://starbase.sysu.edu.cn/)所包含的8个数据库,预测miR-1-3p潜在下游靶基因,使用TCGA数据并结合肺腺癌表达谱芯片,筛选出候选靶基因PRC1。使用western blot检测肺腺癌细胞(A549,H1299和H1975细胞)和正常肺泡上皮细胞(HPAEPIC细胞)中PRC1表达差异。同时进一步检测三种肺腺癌细胞miR-1-3p过表达情况下下游PRC1的表达变化。使用qRT-PCR检测肺腺癌组织及细胞与正常肺组织及细胞中miR-1-3p和PRC1基因基础表达水平并分析相关性。使用荧光素酶报告基因实验确认PRC1是否是miR-1-3p的直接靶基因。为确认PRC1是否可以补偿上游miR-1-3p过表达对肺腺癌的调控影响,采用rescue实验检测PRC1过表达是否可以逆转miR-1-3p过表达对肺腺癌细胞的影响。免疫组化检测具有随访资料的患者肺腺癌组织和正常癌旁组织PRC1的差异表达。使用TCGA数据分析PRC1在肺腺癌及正常组织中的表达差异。随访患者信息及以及与肿瘤相关的临床资料(包括肿瘤大小、TNM分期、周围淋巴结及远处转移情况等),结合PRC1表达水平,分析PRC1的临床意义。使用TCGA数据分析PRC1对肺腺癌患者的预后影响。研究结果在stabrase网站中的PITA数据库中预测到miR-1-3p与PRC1的3’-UTR存在互补碱基配对,结合肺腺癌的表达谱芯片和TCGA数据,筛选出PRC1可能是miR-1-3p的靶基因,且二者存在强烈的负相关性(R=-0.415,p=9.58E-23)。为了验证这一发现,我们使用western blot检测肺腺癌细胞(A549,H1299和H1975细胞)和正常肺泡上皮细胞(HPAEPIC细胞)中PRC1翻译水平差异表达,结果表明,PRC1在3种肺腺癌的表达水平高于正常肺泡上皮细胞。并且三种肺腺癌细胞miR-1-3p过表达后,PRC1表达水平降低。应用qRT-PCR检测发现,PRC1在肺腺癌组织及细胞转录水平的表达亦高于正常肺组织及细胞,与miR-1-3p的表达呈负相关。荧光素酶报告基因实验中,miR-1-3p可以降低构建的PRC1基因3’ UTR野生载体而非突变载体的荧光活性,表明miR-1-3p通过结合到PRC1基因3’ UTR发挥作用。Rescue实验结果显示,在miR-1-3p过表达细胞中补充PRC1后,降低的侵袭及转移能力重新恢复。免疫组化结果显示PRC1在肺腺癌组织中表达水平高于正常肺组织。TCGA数据亦表明PRC1在肺腺癌组织中表达水平明显高于正常肺组织,且PRC1表达水平越高,提示患者较早发生转移(TNM分期越晚)及预后较差。研究结论肺腺癌中PRC1是miR-1-3p的关键下游靶基因,二者表达负相关。PRC1在肺腺癌组织和细胞中高表达。PRC1过表达显著逆转miR-1-3p过表达对肺腺癌转移及侵袭所带来的影响。PRC1的高表达提示肿瘤易出现早期转移,预后较差。第三部分PRC1在肺腺癌下游分子调控机制筛选及验证研究研究目的目前确定miR-1-3p通过PRC1基因发挥作用,但通过PRC1基因下游哪种途径和机制调控肺腺癌的进展,尚不明确。本部分研究旨在通过转录组芯片技术筛选PRC1下游潜在作用机制,并给予验证。研究内容和方法应用siRNA对A549细胞转染,干扰细胞PRC1基因的表达,构建PRC1沉默表达细胞系。应用转录组测序分析来评估PRC1干扰后的A549细胞和对照细胞的基因表达谱。选择[log2(Fold change)]≥1和q<0.05的差异基因作为显著差异基因。为了进一步研究PRC1介导的功能改变及相关机制,我们对所有差异基因进行 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。并通过qRT-PCR确定该通路几个代表基因在PRC1干扰后的A549细胞转录水平。此外,在肺腺癌标本中,应用Spearman秩相关分析分析PRC1与代表基因之间转录水平表达的相关性。研究结果结果显示,siRNA对于干扰PRC1的表达具有很高的效率,选择干扰效率最高的siRNA-3转染A549细胞进行转录组测序分析。利用转录组测序分析来评估PRC1干扰后的A549细胞和对照细胞的基因表达谱,鉴定了 PRC1干扰后A549细胞10936个差异表达的基因,包括8887个下调DEGS和2049个上调DEGS。同时绘制了所有差异表达基因的聚类图。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析结果显示,Wnt,VEGF,Toll-like receptor,Toll and lmd和TNF通路明显富集,其中Wnt通路在PRC1干扰后的细胞中下调最明显。通过qRT-PCR确定Wnt通路内的几个代表基因在PRC1干扰后的A549细胞转录水平降低,如Myc,CCND1,CTNNB1,Jun和RHOA。此外,在10例肺腺癌标本中,应用Spearman秩相关分析显示,PRC1转录水平表达量与β-catenin,Myc,Jun和RHOA正相关。研究结论通过转录组测序分析发现PRC1表达沉默后差异基因主要富集在Wnt信号通路,在细胞株及人体组织中进一步应用RT-PCR方法验证发现PRC1基因与Wnt信号通路代表基因之间存在正相关关系。本研究创新点本文重点研究了 miR-1-3p在肺腺癌发生发展过程中的生物学功能及相关机制,创新之处有以下几点:1.系统分析了 miR-1-3p在肺腺癌中的表达及功能,其抑癌miRNA的角色得到全面证实。2.首次证明PRC1是miR-1-3p的直接下游靶基因,其促进肺腺癌发生发展的作用受到miR-1-3p负性调控。3.首次阐明miR-1-3p及PRC1在肺腺癌中的临床意义及作用机制。4.阐明PRC1受Wnt信号通路调节发挥作用