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目的:重症肌无力(MG)是一种自身免疫性的神经-肌肉接头疾病,其发病与B细胞产生的多种抗体相关,而调节性T细胞(Treg)可抑制自身反应性B细胞的活化,使致病性抗体产生减少,阻止MG发生或进展。但是当Treg细胞线粒体自噬降低时,其免疫抑制功能会受损。本研究拟采用线粒体自噬激活剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)和线粒体自噬抑制剂环孢素A(Cs A)体外调节MG患者Treg细胞的线粒体自噬状态,观察细胞代谢过程中线粒体质量、活性氧(ROS)水平、乳酸产量及细胞凋亡等指标的变化,探讨外周血Treg细胞线粒体自噬异常参与MG发病的细胞代谢机制。方法:1.选择15例临床确诊的MG患者作为实验组,另选择15例健康成年人作为对照组。2.于肱静脉处采取静脉血30 ml,采用Ficoll密度梯度离心法分离得到单个核细胞,然后再用基于分离柱的免疫磁珠分选法分选出CD4+CD25+Treg细胞,台盼蓝染色检测细胞存活率后通过流式细胞仪鉴定Treg细胞的纯度。3.将获得的Treg细胞进行分组,健康成年人的Treg作为对照组,MG患者的Treg分为3份,分别为MG组、MG经CCCP诱导培养24 h组(MG-CCCP)和MG经Cs A诱导培养72 h组(MG-Cs A)。4.收集各组细胞,线粒体绿色荧光探针标记,流式细胞仪检测各组细胞中线粒体质量受损的细胞所占比例。5.收集各组细胞,采用酶标仪检测570 nm处标准孔和样本孔吸光度[D(λ)]值,根据标准孔绘制标准曲线,然后根据标准曲线计算各组细胞的乳酸水平。6.DCFH-DA活性氧探针标记各组细胞,流式细胞仪检测各组ROS水平正常的细胞比例及平均ROS水平。7.Annexin V+PI染色标记对照组、MG、MG-CCCP、MG-Cs A各组细胞,流式细胞仪检测各组细胞中凋亡细胞所占比例。结果:1.细胞纯度:磁珠分选得到的CD4+CD25+Treg细胞存活率为(98.48±0.69)%;Treg细胞经FITC-CD4、PE-CD25、APC-127抗体标记后流式细胞仪鉴定,CD4+CD25+Treg纯度为(93.36±1.87)%,CD4+CD25+CD127low/-Treg纯度为(66.35±1.61)%。2.线粒体质量:流式细胞仪检测各组Treg细胞中线粒体受损细胞所占比例,与对照组(1.09±0.64)%比较,MG组(20.81±2.59)%线粒体受损细胞所占比例升高(P<0.05);与MG组比较,MG-CCCP组(12.23±2.31)%线粒体受损细胞所占比例下降,而MG-Cs A组(33.82±1.90)%升高(均P<0.05)。3.乳酸水平:酶标仪检测各组细胞在570 nm处吸光度[D(λ)]值,根据标准曲线得到各组细胞乳酸水平,与对照组(21.32±0.87)比较,MG组(37.85±1.04)乳酸水平升高(P<0.05);与MG组比较,MG-CCCP组(26.94±1.25)乳酸水平降低,MG-Cs A组(43.28±1.13)乳酸水平升高(均P<0.05)。4.ROS水平:流式细胞仪检测显示,对照组平均ROS水平为1.21±0.27×104,ROS正常的细胞比例为(94.26±2.05)%;与对照组比较,MG组平均ROS水平(2.68±0.36×104)升高,ROS正常细胞比例(75.51±3.28)%降低(P<0.05);与MG组比较,MG-CCCP组平均ROS水平(3.89±0.30×104)和ROS正常细胞比例(85.15±2.86)%均升高,MG-Cs A组平均ROS水平(6.78±0.44×104)升高,而ROS正常细胞比例(46.80±2.45)%降低(P<0.05)。5.凋亡水平:与对照组(2.87±1.06)%比较,MG组凋亡细胞所占比例(14.39±2.06)%升高(P<0.05);与MG组相比,MG-CCCP组凋亡细胞所占比例(8.35±1.61)%降低,MG-Cs A组凋亡细胞所占比例(21.52±2.26)%升高(均P<0.05)。结论:MG患者Treg细胞线粒体自噬水平降低,导致线粒体质量受损,ROS释放增加,ROS正常细胞比例减少,糖酵解生成的乳酸增多,细胞凋亡增加。CCCP通过促进MG患者Treg细胞线粒体自噬,可清除部分受损线粒体,缓解代谢压力,减少细胞凋亡;而Cs A可通过抑制MG患者Treg细胞线粒体自噬,加剧代谢紊乱,使细胞凋亡增加。由此,我们的初步研究显示,MG患者Treg细胞线粒体自噬异常可能参与MG发病的细胞代谢机制。