九十年代兴起的噬菌体抗体库技术是组合技术与基因工程抗体技术相结合的产物，是抗体工程领域的重大进展，代表着抗体工程的前沿。该技术的出现和发展使人们能够在体外模拟体内细胞产生抗体的全过程，为快速筛选特异性抗体提供了简便而高效的可操作系统，因而具有重要的理论意义和应用前景。 鼠源抗体应用于人体所产生的人抗鼠抗体反应(HAMA)，是影响抗体药物发展的一大障碍，因此发展人源抗体的制备技术十分迫切。近年来，如下两种人源抗体制备技术得到快速发展和应用：利用抗体工程进行抗体的人源化改造和通过构建人源抗体库，筛选针对任意抗原的人源抗体。本文即是对这两项技术所进行的应用研究，通过构建两种不同功能的全合成抗体库：一是CD28鼠源抗体的人源化改型库，二是没有任何抗原偏向性的全套抗体库，从两个角度探讨了人源抗体的制备技术。对以上两个抗体库的构建和筛选工作证明了建库方法的可行性，并获得有价值的人源抗体，有望用于抗体药物的开发。 1 全合成人源抗体库的骨架构建及子库的构建与筛选 高质量全套抗体库为制备针对任意抗原的人源抗体提供了重要的分子来源，因而具有重要的基础研究和应用价值。作为抗体制备技术研究的重点和热点，构建大容量高质量全套抗体库是一项有意义而又繁琐的工作。本文针对现有抗体库在构建中存在的一些质量缺陷加以改进，采用全合成的方法作为噬菌体抗体库的构建方法。本文所采用的抗体骨架序列来自文献报道的具有较好的代表性和良好的表达折叠性能的抗体骨架序列。根据大肠杆菌偏好密码子对该序列进行了重新设计和拆分后，合成寡核苷酸片段，利用重叠PCR法进行抗体重轻链可变区基因序列的拼接，经测序证实，最终获得正确的7条重链与7条轻链可变区的抗体骨架序列。经过重轻链骨架序列的组装，最终获得49条单链抗体骨架序列。选用一条在人抗体库中使用频率最高的抗体骨架序列K3H3，以分组式合成法合成随机化CDR3序列，进行了抗体子库模式库的构建和初步筛选，构建得到库容量为10~7全合成抗体库。随后对抗体库的质量分析表明，阳性重组率高于95％，功能性坑体分子的表达率约为88%，该结果高于用传统刊N翼方法合成CDR区的半合成抗体库。通过对人外周淋巴组织趋化性细胞因子(s LC)重组表达的纯抗原筛选实验证明，该库具有较好的应用价值。2应用噬菌体抗体库技术实现抗CD28单域抗体的人源化改造 在抗体工程数十年的发展过程中，人们获得了无数鼠源单克隆抗体，其中相当一部分具有良好的临床应用前景。但是，鼠源抗体极易引起人体排异反应的特点，限制了这些抗体在疾病治疗领域的应用。通过抗体改型进行鼠源抗体的人源化改造，能充分利用现有的抗体资源，因而一直是抗体工程研究的热点之一。 CD28分子是T细胞活化和增殖过程中最重要的共刺激信号接受体，随着双信号识别理论的确立及CD28分子的探入研究，发现抗CD28单克隆抗体可以同B7家族一样传递共刺激信号，替代CD28的天然配体(B7)与CD28结合产生协同刺激信号，，辅助TCR/CD3介导的第一信号途径，活化T细胞和促进T细胞增殖，分泌多种细胞因子。在临床上，抗CD28抗体己作为免疫抑制剂用于器官移植和自身免疫性疾病的预防。- 本论文对一株几鼠源抗CD28单抗9.3的轻链进行人源化改造，并与本实验室己构建成功的人源化抗CD28单域抗体重链基因相连，构建成为人源化抗CD28单链抗体，为临床应用奠定基础。 本实验设计以定向分子进化理论为基础，采用非计算机同源模建方法构建改型抗体库，无需对抗体序列进行空间模拟来确定需要移植的骨架区上的关键氨基酸残基;该改型方法将抗体的改型及亲和力的成熟于同一步骤完成，从而节省构建的时间及劳动强度。