第一部分不同剂量芬戈莫德对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)小鼠预防及治疗效果的研究目的:拟用不同剂量芬戈莫德干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠,通过病理和症状评分分析芬戈莫德预防及治疗效果,选择安全有效的剂量为下一步实验做准备。方法:1 EAE模型的建立:应用抗原100 mg MOG35-55免疫8-10周C57BL/6小鼠,并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂(CFA),加入结核杆菌H37Ra使其终浓度为4 mg/ml,充分混合乳化。乳化后按每只小鼠0.1 ml于脊柱两侧分四点皮下注射,第0 h及第48 h腹腔注射0.5 ml百日咳毒素(PTX)(500 ng/只)。2建立动物模型后,分别用不同剂量的芬戈莫德(2.0 mg/kg,1.0mg/kg,0.3 mg/kg,0.1 mg/kg)干预EAE小鼠。采用Knoz评分法对实验小鼠评分,连续观察28天,具体评分标准如下:0分无症状;1分尾部失去张力;2分尾部无力伴随后肢力弱;3分后肢瘫痪;4分后肢及前肢瘫痪,被动翻身后不能复原;5分濒临死亡或死亡。症状介于两者标准之间者以土0.5分计算。“每日积分均值”由当日组内所有动物分值总和除以该组动物数量所得。评估不同剂量芬戈莫德干预EAE小鼠的效果,选择安全有效的剂量进行下一步实验。3当EAE小鼠发病后(评分≥1分),给予芬戈莫德治疗,每天进行神经功能评分,评估芬戈莫德的治疗效果。4 EAE小鼠模型建立后第1天,给予芬戈莫德(1.0 mg/kg)干预,在免疫后21天(疾病高峰期),取材脊髓进行组织病理学观察。小鼠经水合氯醛麻醉后,4%多聚甲醛灌流,取脊髓腰骶段石蜡包埋,5μm连续切片。在光镜下,用苏木精-伊红染色(HE染色)评价脊髓切片的炎症细胞浸润情况,用快-蓝染色(lbf染色)评价小鼠脊髓腰膨大处髓鞘脱失情况,采用半定量、双盲的方法对每只小鼠脊髓三个不连续切片进行评定(同以往研究标准),对每张脊髓切片选取5个高倍(400)视野进行炎性浸润情况及髓鞘脱失评分,计算每只小鼠平均评分。he染色炎症评分标准:0分没有炎症;1分炎症细胞只浸润血管和脑脊膜周围;2分少量炎症细胞浸润脑或脊髓实质(1-10个/切片);3分中量炎症细胞浸润脑或脊髓实质(11-100个/切片);4分大量炎症细胞浸润脑或脊髓实质(大于100个/切片)。lfb评分标准:0分正常脑或脊髓白质;1分点状脱髓鞘;2分小片状脱髓鞘;3分血管周围融合的或者单纯脱髓鞘;4分累及半侧脊髓的广泛脱髓鞘;5分累及整个脊髓的广泛脱髓鞘。每组取小鼠1只,2.5%戊二醛灌注固定半小时以后,在冰上迅速取脊髓并保存于4%戊二醛电镜保存液中数天后,取脊髓后索部位用新鲜刀片切成1mm正方形小块,经过饿酸固定,梯度脱水,包埋剂浸透包埋,修块,切片等过程后制成切片在透射电镜下定性观察髓鞘和轴索的形态学变化。5采用spss18.0软件进行统计分析,各项指标以均数±标准差表示(mean±sd);临床神经功能评分资料应用mann-whitneyu检验;样本率的比较应用χ2检验,其余计量资料均数的两组间比较应用anova方差分析。p<0.05具有统计学意义。结果:1不同剂量(2.0mg/kg,1.0mg/kg,0.3mg/kg,0.1mg/kg)的芬戈莫德干预eae小鼠,其中2.0mg/kg,1.0mg/kg和0.3mg/kg组效果均明显。组间比较发现1.0mg/kg组与2.0mg/kg同样有效,而优于0.3mg/kg和0.1mg/kg组,因此,选择1.0mg/kg剂量芬戈莫德进行下一步实验。2eae小鼠发病后(评分≥1分),随机分成eae组和芬戈莫德治疗(1.0mg/kg)组,发现芬戈莫德能够明显逆转eae小鼠的临床评分。3脊髓切片的he染色、lfb染色以及电镜发现,空白对照组脊髓腰膨大背外侧索几乎没有炎症细胞浸润,髓鞘脱失也不明显,eae组小鼠炎症细胞浸润较多、髓鞘脱失明显,芬戈莫德组小鼠炎症细胞浸润和髓鞘脱失明显减少,表明芬戈莫德能够有效减轻eae的炎症细胞浸润和髓鞘脱失情况。第二部分芬戈莫德调节实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(eae)小鼠th1/treg细胞的分化和功能目的:用芬戈莫德干预eae小鼠,分析对th1和treg细胞的分化和功能的影响,探讨芬戈莫德对eae小鼠的免疫调节作用。方法:1eae模型的建立:应用抗原100mgmog35-55免疫8-10周c57bl/6小鼠,并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂(cfa),加入结核杆菌h37ra使其终浓度为4mg/ml,充分混合乳化。乳化后按每只小鼠0.1ml于脊柱两侧分四点皮下注射,第0h及第48h腹腔注射0.5ml百日咳毒素(ptx)(500ng/只)。2在疾病高峰期取材脾,按照流式样品要求制备小鼠脾的单细胞悬液,应用流式细胞仪检测三组(空白对照组,eae组和芬戈莫德组)小鼠脾中th1和treg细胞的比例。收集脾细胞,并用rpmi1640液冲洗,然后将脾细胞悬液加入到无菌的24孔细胞培养板中,同时加入mog35-55进行培养24小时。加入流式细胞学刺激剂:phorbol12-myristate13-acetate(pma)50ng/ml、ionomycin(iono)1000ng/ml和brefeldina(bfa)5μg/ml,13小时后收集细胞培养液,treg细胞不需要刺激剂直接进行检测。按照流式表面染色方法分别标记fitc标记的小鼠cd4抗体或者fitc标记的小鼠cd4抗体/apc标记的小鼠cd25抗体。细胞内因子加入pe标记的小鼠ifn-γ抗体和apc标记的小鼠il-4抗体,或者pe标记的小鼠foxp3抗体。大于1×105细胞数混悬液上机进行检测。3在疾病高峰期取材脾,用elisa方法测定各组c57/bl6小鼠脾细胞上清液中ifn-γ和tgf-β的表达,用real-timepcr方法测定小鼠脾细胞中ifn-γ和tgf-β基因的表达。取收集的脾细胞培养液上清液,按照各试剂盒的操作说明书进行ifn-γ和tgf-β的定量分析测定。提取总rna,rna逆转录为cdna。qrt–pcr反应条件:94℃预变性30sec;94℃变性15sec,60℃退火15sec、72℃延伸10s,重复40个循环。4在疾病高峰期取材脊髓,用real-timepcr方法测定三组小鼠(空白对照组、eae组及芬戈莫德组)脊髓中ifn-γ和tgf-β基因的表达,用免疫组化方法测定小鼠脊髓中tgf-β的表达。每组各取6只小鼠,经水合氯醛麻醉后,4%多聚甲醛灌流,取脊髓石蜡包埋,5μm切片,加入tgf-β抗体4℃冰箱过夜,冲洗后用二抗标记,dab显色,高倍显微镜下观察。5采用spss18.0软件进行统计分析,各项指标以均数±标准差表示(mean±sd);计量资料均数的两组间比较应用anova方差分析。p<0.05具有统计学意义。结果:1eae小鼠脾细胞中th1和treg细胞的比例发生了不同变化,与正常对照组相比,eae小鼠的th1细胞比例明显升高,treg细胞比例明显下降;芬戈莫德组小鼠th1细胞比例较eae小鼠显著降低,但treg细胞比例显著升高。2与正常对照组小鼠比较,eae小鼠脾中ifn-γ水平明显升高,tgf-β水平明显降低;而芬戈莫德组小鼠ifn-γ水平表达显著降低,tgf-β水平表达显著升高。以上变化在基因水平改变相同。3免疫组化方法测定小鼠脊髓中tgf-β的表达,发现eae小鼠tgf-β表达较空白对照组减弱,芬戈莫德干预组小鼠较eae小鼠tgf-β表达增强。4应用real-timepcr方法检测小鼠脊髓中细胞因子的表达,与空白对照组比较,eae组小鼠上调了ifn-γ基因的表达,下调了tgf-β基因的表达;与eae组小鼠比较,芬戈莫德干预显著下调了ifn-γ基因的表达,上调了tgf-β基因的表达。第三部分芬戈莫德对实验性脑脊髓膜炎(eae)小鼠的免疫调节功能与akt-mtor信号通路相关目的:用芬戈莫德干预eae小鼠模型,进一步探讨akt-mtor信号传导通路在eae中所发挥的免疫调节作用,期望为多发性硬化的治疗提供新思路,并且为芬戈莫德应用于治疗神经系统其它疾病寻找新方向。方法:1eae模型的建立:应用抗原100mgmog35-55免疫8-10周c57bl/6小鼠,并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂(cfa),加入结核杆菌h37ra使其终浓度为4mg/ml,充分混合乳化。乳化后按每只小鼠0.1ml于脊柱两侧分四点皮下注射,第0h及第48h腹腔注射0.5ml百日咳毒素(ptx)(500ng/只)。2在疾病高峰期取材脾,用real-timepcr方法测定不同组小鼠脾细胞中t-bet和foxp3基因的表达。3在疾病高峰期取材脾,从小鼠脾细胞中提取总蛋白,用westernblot方法检测空白对照组、eae组及芬戈莫德干预组小鼠akt,pakt,s6k及ps6k的表达。从脾细胞中提取总蛋白,bca法检测蛋白浓度。根据蛋白浓度上样,之后电泳。电泳结束后,使用转移电泳装置,在4℃,100v恒压条件下电转120min,将蛋白转移到pvdf膜上。用封闭液(含5%脱脂牛奶的tbst溶液)室温封闭pvdf膜1小时。一抗孵育:封闭液稀释抗体,然后与封闭好的pvdf膜4℃过夜。二抗孵育:用封闭液稀释相应的二抗,室温下孵育pvdf膜。将膜经凝胶成像仪成像,分析结果。4采用spss18.0软件进行统计分析,各项指标以均数±标准差表示(mean±sd);计量资料均数的两组间比较应用anova方差分析。p<0.05具有统计学意义。结果:1与正常对照组比,eae小鼠脾细胞中t-bet基因表达上调,foxp3基因表达下调。与eae小鼠相比,芬戈莫德组小鼠的t-bet基因表达显著下调,foxp3基因表达显著上调。2在疾病高峰期,eae小鼠pakt/akt和ps6k/s6k的表达较正常对照组小鼠增多,而芬戈莫德组小鼠pakt/akt和ps6k/s6k的表达比eae组小鼠显著减少。结论:1芬戈莫德能够阻止eae病情,减轻eae小鼠脊髓中炎症细胞的浸润及髓鞘的脱失,并且能够逆转eae小鼠病情。2eae发病影响了小鼠体内th1和treg细胞的分化和功能,芬戈莫德治疗eae小鼠,能够调节th1和treg细胞的分化和功能。3eae小鼠发病激活了akt-mtor信号通路,芬戈莫德通过抑制该信号通路调节了免疫反应,提示我们akt-mtor通路抑制剂可能成为治疗多发性硬化的新靶点。