细菌是一种体形微小、结构简单并广泛存在于自然界的原核微生物。人类自诞生以来就一直跟细菌保持着密切的联系。一方面,细菌可以被人类所利用,构建各种工程菌用于食品生产、药品生产及环境净化等。另外一方面,细菌会分解食品中的营养物质,导致食品营养流失、风味改变及保质期内变质;一些具有重大危害性的致病菌的存在直接威胁到消费者的生命健康;多重耐药菌的出现及其快速传播则把人类推向了“后抗生素时代”的边缘,人类将面临着“无可救药”的危险。因此,细菌的检测和研究对于食品的质量控制、食品的安全监管、耐药菌的控制及其安全风险评估等具有重要的指导意义。流式细胞术作为一种可以在单细胞水平进行快速、定量、多参数同时表征的分析技术,得到了细胞生物学领域科学家们的青睐。如果把流式细胞术的普适性拓展到细菌领域,则可以为细菌的检测和研究提供一个广阔的平台。然而,细菌的个体非常小,自身表达的生物分子数目较低,无法标记足够多的荧光探针;因此,细菌产生的散射光和荧光信号都较弱,导致传统的流式细胞仪在细菌的高灵敏检测方面存在较大的局限。结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,本实验室在过去的十几年致力于发展纳米流式检测技术(nano-flow cytometry,nFCM)。实验室自行研制的纳米流式检测装置(nano-flow cytometer,nFCM)的散射检测灵敏度较传统流式细胞仪提高3-5个数量级,荧光检测灵敏度较传统流式细胞仪提升几百倍,可以轻松实现细菌的单细胞多参数定量检测。基于上述研究成果,本论文把样品预处理技术、核酸及免疫荧光染色技术和nFCM多通道检测相结合,创建基于nFCM的多种细菌检测方法,并应用于酸奶、果汁等食品中的细菌检测。此外,针对细菌耐药研究的紧迫性,本论文利用nFCM高灵敏、高通量的优点,发展了多重耐药质粒接合传递的定量检测方法,结合理论模拟对耐药菌的传播机制进行了探讨。本论文主要包括以下几个方面的内容:第一章为绪论。主要介绍细菌与人类的关系、细菌的检测和分析方法进展、流式细胞仪在细菌检测和分析中的应用及面临的挑战,并对本论文的选题思路进行阐述。第二章建立了一种基于nFCM的快速、定量检测乳酸菌浓度和活菌比率的方法。本章以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)作为乳酸菌模型菌,将其加入到纯牛奶和脱脂奶粉溶液中分别模拟酸奶和乳酸菌饮料中的复杂颗粒成分,优化样品的处理方法。使用核酸染料SYTO 9和PI对样品中的乳酸菌进行染色,这两种染料可以同时被488 nm激光激发,分别在绿色和红色的荧光通道被检测。其中跨膜染料SYTO9能够同时对活菌和死菌进行染色,非跨膜染料只能对细胞膜破损的死菌进行标记。根据能够同时被两种核酸染料染色以及仅能被SYTO 9标记的细菌数目换算得到死菌和活菌的浓度。nFCM检测活性乳酸菌的结果与平板培养法检测的结果具有良好的一致性,相关指数R2>0.99。使用该方法,本论文成功地实现了对各品牌益生菌乳制品的检测,比较了不同品牌及相同品牌不同批次乳制品中的乳酸菌总浓度和活菌比率。第三章主要介绍如何使用nFCM实现对果汁中细菌总浓度的检测。在使用nFCM测定果汁的过程中我们发现:果汁中存在大量携带核酸的颗粒物质,通过传统的核酸染色的方法并不能把细菌跟果汁中的颗粒物质区分。与此同时,我们注意到,在激光488 nm激发下细菌自身带有微弱的荧光信号,这些荧光信号主要来自于由核黄素及其衍生物组成的小分子。因此,我们设想:利用nFCM的超高灵敏特性,通过自发荧光分析实现果汁中细菌的无标记检测。然而,果汁的颗粒浓度很高(>109 particle/mL),且存在类似核黄素的自发荧光分子,给细菌的无标记检测带来了严重干扰。为此,我们通过样品预处理方法的优化,减小果汁的荧光背景并降低果汁的颗粒浓度,最终实现了细菌和果汁颗粒的明确分辨。使用nFCM通过自发荧光检测橙汁中人为添加的大肠杆菌E.coli ER2738,其检测结果与使用平板培养法的检测结果比具有良好的一致性,相关系数R2>0.98;对苹果汁中的细菌检测下限为102 cells/mL。第四章建立了基于nFCM的检测耐药质粒接合传递的方法。首先以E.coli O157:H7为受体菌,通过抗生素传代诱导培养使其带上抗生素耐药标记。然后以E.coli HB101(RP4)为供体菌,通过供体菌受体菌的接合和抗生素平板筛选获得接合子E.coli O157:H7(RP4)。以上述三种菌为标准菌株,建立了免疫荧光双染色的方法:先对E.coli O157:H7表面抗原进行免疫荧光染色,使受体菌和转化子带上红色荧光;再对细菌中的β-内酰胺酶进行免疫荧光染色,使供体菌和转化子带上绿色荧光。使用nFCM的三通道(散射、绿色荧光和红色荧光)同时检测实现了供体菌、受体菌和接合子的明确分辨和定量检测。第五章探讨了抗生素影响耐药菌传播的机制。基于第四章所建立的检测方法考察了抗生素对质粒接合动力学的影响。结果表明:在高接合效率和选择压同时存在的条件下新出现的耐药菌会迅速发展成优势菌。系统地考察了 13种抗生素对质粒接合传递效率的影响,结果表明:抗生素并不能提高质粒的接合传递效率,而且抑制蛋白合成类抗生素在整体水平上抑制蛋白合成,从而抑制质粒的接合传递。通过理论模型的构建和实验结果的对照,我们还发现耐药菌的传播速度不仅跟抗生素污染或滥用程度有关,还跟温度和营养水平等影响细菌更新换代速度的因素相关。我们的数据首次揭示了在抗生素污染或滥用的背景下气候变暖和环境富营养化会加速耐药菌的垂直传播。第六章为总结和展望。总结了本论文的研究结果和不足之处,以及展望了未来的研究方向。