研究背景：世界卫生组织(WHO)发表的《全球癌症报告201.4》),肝癌的发病率和死亡率分别为6%和9%。同时,在全球范围内来看,肝癌在肿瘤相关性死亡病因里排名第二。2012年全球新发肝癌病例大约为782500。中国的人口只占世界总人口的1/4,但肝癌患者数大约占了全球肝癌患者的1/2,是实实在在的肝癌大国。在过去的50年里,虽然全球在不断的增加肿瘤治疗方面的研究资金,比如美国,在2009年的美国国家癌症研究所科研预算就达到了60亿美金,然而,纵观50年来癌症的治疗效果,并没有显著的改善,肝癌也是如此。目前的肝脏肿瘤治疗方法主要有(1)手术治疗；(2)肝脏移植；(3)化学药物治疗；(4)消融疗法；(5)中医中药治疗以及以上方法的联合治疗。其中,手术切除和肝脏移植是最有可能治愈肝癌的方法；但是肝脏移植由于受到供肝来源少,受体匹配条件高,费用高昂等原因,肝脏移植并不能广泛的应用于临床。因此,目前手术治疗被认为是首选的最有可能治愈肝癌的方法。如果我们通过手术能把整个实体瘤完全切除,那么肿瘤患者是可以治愈的。但是,目前肝癌患者手术切除后,五年复发率接近100%,5年生存率为5%。造成以上结果的主要原因有：1.现有的术前常规检查手段CT、MRI、B超等,由于自身的分辨率的限制,对于直径小于lcm的肿瘤难以有效的诊断,术前诊断、决策也容易忽略这类肿瘤诊断,术中未能切除,造成术后的复发转移；2.在术中,医生综合术前影像学资料,术中的视诊,触诊情况(肿瘤组织的色泽、形态、质地等)以及临床经验判断肿瘤的位置和边缘,难以客观的评判肿瘤的位置和边缘,医师依靠主观判断切除肿瘤,因此,手术切缘是否有癌灶残余,是否有微小转移癌灶的残留等问题就难以客观的评判。肿瘤患者体内微小肿瘤残余,手术切缘尚残留肿瘤细胞(阳性切缘),那么患者术后肿瘤复发,预后差的结局就在所难免。而且,对于术后复发的肿瘤患者,二次手术或者术后化疗的效果也极其的有限。因此,外科医师需要一种技术可以辅助临床医师发现微小肿瘤和精确定位肿瘤边界,术中实时、准确、客观的提供肿瘤位置和边界,临床医师参考以上信息,在术中彻底的切除肿瘤,获得阴性切缘,减少术后复发率,这对于提高肿瘤患者术后生存率,改善他患者的生活质量具有非常重要的意义。在临床肿瘤治疗方法研究中,自2008年日本医生开始将光学分子影像手术导航系统应用于肝脏肿瘤切除手术后,术中实时荧光导航技术受到临床医生们的关注。与传统的临床成像系统相比,术中荧光成像拥有低成本、简单容易、安全(比如没有辐射)、实时、高分辨率,高灵敏度等优势,高分辨率以及高特异性识别更是它的优势。目前在临床上研究比较成熟的荧光导航方法是基于吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)为荧光材料的近红外荧光手术导航仪。这项技术已经应用于乳腺癌前哨淋巴结检测、胃癌转移淋巴结检测、原位肝癌、肝癌转移灶、结直肠癌肝转移等外科手术。但是,由于ICG没有主动靶向性,水稳定性、易与脂蛋白结合导致在体内快速被肝脏清除(血浆中半衰期为2-4min)通过胆道系统、消化道以原型排出体外。使得肿瘤摄取ICG的量非常的有限,而且在肝脏肿瘤的应用中,其假阳性达到了40%-50%,这些都限制了ICG以及这种手术导航方法在其他肿瘤方面的研究与应用。为了克服这些困难,实现荧光手术导航方法更好的应用于肿瘤的诊断与治疗,科学家们开始借助不同的分子探针,联合磁共振、光学、核素和超声等影像学技术,实现了对单个细胞、乃至与单个分子的非侵入式显像；同时,主动靶向探针作为荧光手术导航介质的方法也是目前国际研究的热点。在2010年,钱永健团队应用荧光分子影像主动靶向探针ACPPDs在荧光手术导航仪的辅助下对裸鼠皮下乳腺癌肿瘤进行了荧光导航的切除,发现这种方法与传统方法切除裸鼠皮下乳腺癌肿瘤相比,荧光手术导航组的裸鼠的肿瘤残余率低,术后的生存率得到明显的改善。在2013年,钱永健团队应用ACPPDs对于乳腺癌淋巴结转移的裸鼠进行研究,结果指出,这种主动靶向的荧光探针可以定位乳腺癌淋巴结转移灶,并实时指导转移淋巴结的切除。在2014年, Debadyuti Ghosh团队,应用主动靶向探针SBP-M13-SWNT对亚毫米的卵巢癌肿瘤进行靶向诊断,并且进行了实时荧光手术导航。在临床应用方面,在2013年,Matthew B. Sturm团队应用主动靶向早期食管肿瘤的荧光探针ASY*-FITC完成了首例人体试验,而且手术效果良好。在众多光学成像方面,近红外荧光成像是一种特殊类型的荧光,同时也是目前光学荧光成像中的一个重要发展趋势,与常规光学相比,近红外荧光(650 to 900 run)受生物组织本底的影响小,在生物组织内吸收衰减和散射小,从而具有组织中的穿透能力强、背景噪声小和产生的信背比高。近红外荧光手术导航仪具有以上优势,但在肿瘤诊疗应用中受制于没有理想的近红外荧光探针,所以近红外荧光成像探针的研发一直是分子影像研究的挑战。同样的,具有肿瘤特异性靶向的近红外荧光分子探针仍然缺乏。所以仍需要投入大量的科研来寻找更多的能够用于近红外荧光手术导航仪的荧光分子探针。在本实验研究中,我们针对近红外荧光手术导航下,手术切除肝脏肿瘤研究的热点问题,利用具有良好生物相容性的多介孔二氧化硅(mesoporous silical nanoparticals,MSNs)硅球材料作为分子探针的载体,用ICG作为近红外荧光染料,并用RGD多肽进行靶向修饰后构建成能够主动靶向整合素蛳p3受体的近红外荧光探针,并建立人肝癌皮下肿瘤裸鼠模型、’人肝癌原位肿瘤裸鼠模型和人乳腺癌转移性肝癌裸鼠模型,探讨靶向探针的生物适应性,主动靶向性,靶向成像效果和术中实时荧光手术导航的应用价值。研究目的：本研究的目的是制备一种主动靶向整合素嘶β3受体的近红外荧光纳米探针,可以在术中实时的精确定位肝脏肿瘤的位置和边界,为术者在术中实时提供客观的手术切缘参考,实现精准的荧光手术导航切下切除肿瘤。研究方法：1.多介孔硅球的合成和观察水热合成法合成多介孔硅球,扫描电镜和透射电镜观察多介孔硅球的形貌和大小；粒度仪检测多介孔硅球的水合粒径与粒径分布特征。2.主动靶向探针的合成与化学表征将吲哚菁绿超声震荡上载入多介孔硅球中,聚乙二醇修饰后,加入RGD多肽溶液制备成主动靶向嘶β3受体的近红外荧光纳米探针(ICG/MSNs-RGD)。扫描电镜和透射电镜观察靶向探针的形貌和大小,粒度仪检测探针水合粒径与分布；荧光分光光度计检测靶向探针及ICG的发射光谱与激发光谱。3.探针毒性实验、体外靶向探针靶向能力的观察用MSNs和靶向探针(ICG/MSNs-RGD)孵育HepG2肝癌细胞后,再用MTT法评估MSNs和靶向探针的毒性；将αvβ3受体高表达的MDA-MB-231-GFP乳腺癌细胞和αvβ3受体低表达的MCF-7乳腺癌细胞分别用靶向探针(ICG/MSNs-RGD)孵育1小时,用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer solution, PBS)液冲洗干净后,近红外体式荧光显微镜观察两种细胞摄取靶向探针的情况；4.皮下肝脏肿瘤裸鼠模型,原位肝脏肿瘤裸鼠模型和乳腺癌肝转移癌裸鼠模型的建立取20只5-6周雄性BALB/c裸鼠,取含1×107/mL HepG2-GFP细胞悬液接种于裸鼠左腋部皮下,建立裸鼠皮下肝脏肿瘤裸鼠模型。在无菌条件下麻醉裸鼠,经剑突下5 mm处竖直切口开腹部暴露肝脏,沿肝脏被膜下进针,缓慢推入50μL含1×107/mL HepG2-GFP或MDA-MB-231-GFP细胞悬液,逐层关腹,同样方法建立10只5-6周雄性BALB/c裸鼠原位模型或10只5-6周雌性BALB/c乳腺癌肝脏转移裸鼠模型。5.在体研究靶向探针的主动靶向功能取8只皮下肝脏肿瘤裸鼠模型,随机分成两组(每组4只),一组为对照组,经尾静脉注射非靶向探针(ICG/MSNs) 150μL (0.2 mg/mL);一组为靶向探针组,经尾静脉注射靶向探针(ICG/MSNs-RGD) 150μL (0.2mg/mL)。在注射后的10min,12h,24h,48h,72h,96h和120h用IVIS 200分子影像系统观察探针在体分布情况。其中,在24h时,每组分别取一只荷瘤裸鼠,脱颈处死,取肿瘤,心脏,肝脏,脾脏,肾脏等重要脏器,观察探针在各重要脏器的分布情况。同时用IVIS活体成像软件3.0分析肿瘤区域探针代谢数据并绘制曲线。6.探针在皮下肝肿瘤边界的精准定位的应用取3只皮下肝脏肿瘤裸鼠模型,经尾静脉注射靶向探针(ICG/MSNs-RGD, 150μL,0.2 mg/mL)48h后,用近红外体式荧光显微镜系统进行荧光手术导航定位肿瘤位置和边界,同时用肿瘤自带绿色荧光作为定位肿瘤位置和边界的参考标准。术后将肿瘤标本切片后行HE染色,在病理切片水平,用近红外体式荧光显微镜系统定位肿瘤边界与HE染色结果对比,确定近红外荧光导航系统在宏观和微观上均可以精准的定位肿瘤边界。7.探针对于微小皮下肝脏肿瘤的手术导航的应用取12只皮下肝脏肿瘤裸鼠模型,经尾静脉注射靶向探针(ICG/MSNs-RGD, 150μL,0.2 mg/mL)48h后,分成两组,每组6只,两位临床医师在遵循最大限度的切除肿瘤的同时尽最大努力保留正常组织的条件下,分别对6只荷瘤裸鼠进行肿瘤切除,医师在凭借视诊、触诊的主观判断肿瘤已经切除完全后,用近红外荧光体式荧光显微镜系统对手术区域进行检查,评估是否仍有微小肿瘤的残余。如果有微小肿瘤的残余,在近红外荧光体式荧光显微镜系统辅助下继续进行肿瘤切除,直到肿瘤切除干净。最后所有肿瘤标本均进行病理切片观察。8.探针对于肝脏微小原位转移灶的精确诊断及手术导航切除取原位肝癌裸鼠模型小鼠3只,经尾静脉注射靶向探针(ICG/MSNs-RGD, 150μL,0.2 mg/mL)48h后,将小鼠麻醉,经腹正中线开腹暴露肝脏,在近红外荧光手术导航系统导航下,辅助术者定位肝脏肿瘤位置和肿瘤边界,完成肝脏原位肿瘤的手术切除,然后再行腹腔探查。9.探针对于肝脏转移癌及腹腔转移癌的诊断及手术导航切除取乳腺癌肝脏转移裸鼠模型3只,经尾静脉注射靶向探针(ICG/MSNs-RGD,150μL,0.2 mg/mL) 48h后,将小鼠麻醉,经腹正中线开腹暴露肝脏,在近红外荧光手术导航系统导航下,辅助术者定位肝脏转移癌位置和边界,完成肝脏转移癌的手术切除,然后再行腹腔探查。10.组织病理验证将肿瘤组织利用冰冻切片包埋剂(optimum cutting temperature OCT)进行包埋和连续切片,然后将组织切片用苏木素和伊红(H&E)染色法进行染色固定。11.统计学分析连续变量采用均数±标准差(mean±SD)表示,两组组间整体比较采用重复测量资料的方差分析；单因素组内比较采用完全随机设计资料的方差分析；单个时间点比较应用两独立样本的t检验。数据分析应用IBM SPSS 19.0软件进行分析, P<0.05认为差异有统计学意义,绘图及表格软件应用Prim 5.0.研究结果：1.介孔硅球呈规则的球形,粒径约为100nnm,分散性良好。靶向探针ICG/MSNs-RGD保持规格的球形,粒径约为100nm,分散性良好；激发波长(780nnm)和发射波长(837nm)；与ICG相比,发生了3-4nm的红移。2.MTT毒性实验结果表明MSNs和靶向探针ICG/MSNs-RGD具有良好的生物相容性；体外靶向探针特异性评估实验中,在近红外体式荧光显微镜观察到探针ICG/MSNs-RGD孵育后的αvβ3受体高表达的MDA-MB-231-GFP乳腺癌细胞内荧光强度比αvβ3受体低表达的MCF-7乳腺癌细胞内强,MDA-MB-231-GFP细胞摄取了更多的探针ICG/MSNs-RGD.3.在体靶向探针代谢实验中,探针组皮下荷瘤裸鼠在注射探针10min,12h,24h,48h,72h,96h和120h后,肿瘤区域的荧光值随着时间的推移逐渐消退,肿瘤区域与周围正常组织的荧光强度对比值在48h时最大(4.92±0.2),可以选择为最佳手术时间点。在离体肿瘤和器官水平上,可见探针主要分布在肿瘤区域。4.靶向探针在术中可以给术者提供清晰的肿瘤位置和肿瘤边界,为术者提供一个客观的肿瘤边界参考。5.在探针对于微小皮下肝脏肿瘤的手术导航的应用实验中,两位手术医师都可以定位和切除直径为5.01±2.08 mm的大肿瘤。通过近红外体式荧光显微镜的辅助,两位医师分别发现肉眼无法发现的微小残余癌症2个和3个,直径在0.95±0.07mm。切除的总共肿瘤数目为17个,HE染色确定均为肿瘤组织。6.在探针对于原位肝癌裸鼠模型的实验中,经尾静脉注射靶向探针48h后,经腹正中线开腹暴露肝脏,并用近红外体式荧光导航系统辅助术者切除肿瘤,5.09±2.31 mm大小的肿瘤肉眼均能判断,但是0.4±0.21mm微小转移灶通过导航系统能够判断,与周围正常组织的对比度(Tumor to background, TBR)为4.7±0.21。在应用近红外体式荧光导航系统对腹腔进行探测,发现肉眼未能发现的微小癌灶有5个,大小约为lmm,肿瘤区域与正常组织的对比度为TBR=5.23±0.82。7.同样,在乳腺癌肝脏转移模型中,经尾静脉注射靶向探针48h后,经腹正中线开腹暴露肝脏,并用近红外体式荧光导航系统辅助术者切除肿瘤,对于乳腺癌肝转移的肿瘤模型,探针在整个肿瘤内积聚。提供给术者一个清晰的肿瘤定位和肿瘤边界。研究结论：合成的主动靶向整合素αvβ3受体的近红外荧光探针,具有良好的生物适应性,对整合素αvβ3受体具有良好的特异靶向性；在手术过程中实时的辅助术者精准定位肿瘤位置和边界,同时提供良好的信背比。辅助术者在手术中准确定位肿瘤边界和实时的定位亚毫米微小肿瘤(原位肿瘤或转移肿瘤)；给术者提供一个实时的、客观的肿瘤边界和手术切缘的参考,辅助彻底的切除肿瘤。