目的:支气管哮喘（哮喘）是世界范围内常见的慢性呼吸系统疾病,尤其在发达国家更为常见。据WHO统计,目前全球患有哮喘的人数约为3.34亿,随着哮喘发病率的逐年攀升,推测截止至2025年底全球哮喘人数将上升至4亿。哮喘也是儿童慢性呼吸系统疾病中发病率较高的一种,在儿童残疾调整生命年（DALY）中,它位居全球前20位。因此,哮喘给全球健康和经济带来非常沉重的负担。哮喘是以持续存在的气道慢性炎症、气道的高反应性及不可逆的气道重塑为主要特点。不可逆的气道重塑的发生进一步加重气道高反应性,最终导致肺功能进行性及不可逆性的持久损害,其与疾病的预后密切相关。目前有关气道重塑的机制仍不是十分清楚。近年来研究显示气道上皮作为机体与外界过敏及有害刺激接触的第一道屏障,在与过敏或有害刺激接触后可通过上皮间质转分化（EMT）的形式参与气道重塑的过程。因此,进一步探索及认识气道上皮细胞EMT的发病机制成为哮喘防治的热点和重点。MiRNAs分子是多种疾病EMT发生和发展的主要调控分子。越来越多的研究证明miR-21-5p广泛参与多种疾病EMT的过程。我们的预实验提示在哮喘气道重塑动物模型的肺组织中miR-21-5p随气道上皮细胞EMT的进展,表达逐渐增多,且主要存在于巨噬细胞中,提示miR-21-5p与哮喘EMT密切相关。由于外泌体外层脂质双分子膜结构的存在,使外泌体中的miRNAs分子与游离的miRNAs分子相比较,不易降解,具有了较高的生物学稳定性。miRNAs被包装到外泌体中,作为一种旁分泌信使,进一步介导同种或不同种细胞间通讯。这个过程在正常生理、病理生理及病理过程中都具有重要作用。基于以上研究及观点,本研究从外泌体miRNAs角度出发,探索巨噬细胞的miR-21-5p是否可以通过外泌体转移至支气管上皮细胞,影响上皮细胞的EMT过程,并进一步明确巨噬细胞外泌体miR-21-5p影响支气管上皮细胞EMT的机制。研究方法:1、MiR-21-5p在大鼠哮喘气道重塑模型中的表达水平及定位。（1）动物模型制备及标本采集。16只SD大鼠分为2组:PBS-8周组和OVA-8周组。OVA-8周组大鼠在实验的第0、7、14天分别进行OVA联合氢氧化铝腹腔注射致敏,从实验21天开始给予大鼠进行OVA雾化激发,隔日一次,激发持续时间为8周。PBS-8周组用PBS代替OVA对大鼠进行致敏和激发。观察各组大鼠的行为学改变。收集大鼠肺泡灌洗液标本,对其中的白细胞总数进行计数。收集大鼠肺组织标本进行HE染色和Masson染色验证哮喘气道重塑模型的制备,并进一步评价哮喘气道重塑的程度。Western blot方法检测各组肺组织中上皮细胞标志物E-cadherin、间质细胞标志物a-SMA和Vimentin的蛋白表达情况,进一步证明大鼠哮喘气道重塑模型中气道上皮细胞出现EMT的改变。（2）检测大鼠哮喘气道重塑模型肺组织中miR-21-5p表达水平及定位。PCR方法检测miR-21-5p表达水平。FISH联合IF定位miR-21-5p在大鼠肺组织巨噬细胞中的表达。2、LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p对大鼠支气管上皮细胞EMT的影响。（1）培养大鼠肺泡巨噬细胞,用LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞建立细胞炎性模型,分离外泌体。通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒示踪分析（NTA）验证外泌体的形态及分布。利用Western blot检测外泌体表面标记蛋白的表达。利用外泌体分泌抑制剂GW4869及miR-21-5p inhibitor干预技术探讨LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p的表达水平。应用PCR方法检测大鼠肺泡巨噬细胞及其外泌体中miR-21-5p的表达水平。NTA分析外泌体的浓度。（2）培养大鼠支气管上皮细胞,用LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理大鼠支气管上皮细胞建立模型。PKH67标记外泌体,荧光显微镜下观察大鼠支气管上皮细胞对外泌体的摄取情况。利用外泌体分泌抑制剂GW4869干预,探讨经LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理的大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p的表达情况,进一步验证了大鼠支气管上皮细胞对外泌体的摄取及LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p转移至大鼠支气管上皮细胞。PCR方法检测大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p的表达水平。（3）利用外泌体分泌抑制剂GW4869及miR-21-5p inhibitor干预技术探讨LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p对大鼠支气管上皮细胞EMT的影响。Western blot方法检测大鼠支气管上皮细胞中E-cadherin、a-SMA及Vimentin的蛋白表达水平。免疫荧光方法检测大鼠支气管上皮细胞中a-SMA的表达。3、LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p促进大鼠支气管上皮细胞EMT的机制研究。（1）通过独立的在线数据库,Targetscan,我们预测miR-21-5p的靶基因为Smad7和TGFβRII。（2）动物模型中,Western blot联合PCR方法检测PBS-8周组与OVA-8周组大鼠肺组织中TGF-β1、TGFβRII及Smad7在蛋白和m RNA两方面的表达水平。（3）培养大鼠支气管上皮细胞,应用miR-21-5p mimics或inhibitor干预方法探讨miR-21-5p对TGF-β1/Smad7的调控及其在大鼠支气管上皮细胞EMT中的作用。PCR方法检测各组大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p的表达情况。Western blot检测各组大鼠支气管上皮细胞中TGF-β1、TGFβRII,pSmad2,pSmad3,Smad7、E-cadherin、a-SMA及Vimentin的蛋白表达水平,进一步证实TGF-β1/Smad7信号通路的激活情况及其与EMT的相关性。免疫荧光检测大鼠支气管上皮细胞中a-SMA蛋白表达。采用双荧光素酶报告基因检测实验进一步验证在大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p对其目的基因Smad7的抑制作用。（4）利用LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理大鼠支气管上皮细胞建立模型,观察LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p对大鼠支气管上皮细胞TGF-β1/Smad7信号通路的影响。Western blot检测各组大鼠支气管上皮细胞中TGF-β1及Smad7蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p与大鼠支气管上皮细胞中Smad7 3’UTR结合情况。（5）利用LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理大鼠支气管上皮细胞建立模型。应用miR-21-5p mimic或inhibitor、Smad7 siRNA、TGF-β1 siRNA等干预方法探讨LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p对TGF-β1/Smad7的调控机制及其在大鼠支气管上皮细胞EMT中的作用机制。Western blot检测各组大鼠支气管上皮细胞中TGF-β1、Smad7、E-cadherin、a-SMA及Vimentin的蛋白表达水平。免疫荧光检测大鼠支气管上皮细胞中a-SMA蛋白表达。研究结果:1、在大鼠哮喘气道重塑模型中,miR-21-5p定位于巨噬细胞中且表达增多。（1）大鼠哮喘气道重塑模型中,肺泡灌洗液中白细胞数增多（P<0.05）。病理学变化HE染色及Masson染色可见,与PBS-8周组相比,支气管上皮细胞肿胀,部分上皮细胞脱落,管壁及血管周围有大量炎性细胞浸润,管壁增厚,胶原沉积增多,平滑肌增厚。与PBS-8周组相比,大鼠哮喘气道重塑模型肺组织中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白水平表达减少（P<0.05）,间质细胞标志物a-SMA和Vimentin蛋白表达水平升高（P<0.05）。证实了大鼠哮喘气道重塑模型肺组织出现了EMT。（2）PCR结果提示,与PBS-8周组相比,大鼠气道重塑模型肺组织中miR-21-5p的表达水平明显升高（P<0.05）。FISH联合IF定位结果显示,大鼠气道重塑模型肺组织中miR-21-5p表达增多,且其主要存在于巨噬细胞中。2、LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p促进大鼠支气管上皮细胞EMT。（1）LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞建立炎性细胞模型,PCR结果显示大鼠肺泡巨噬细胞中miR-21-5p含量明显升高（P<0.05）。分离及提取外泌体,通过TEM和NTA对外泌体的形态及粒径分布进行验证。Western blot检测外泌体特异性内源性蛋白表达水平。PCR结果显示miR-21-5p在LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体中显著升高（P<0.05）,miR-21-5p inhibitor显著抑制外泌体中miR-21-5p的表达;GW4869没有改变外泌体中miR-21-5p的相对水平,但导致从相同量培养基中分离出的囊泡数量减少。（2）荧光染料PKH67标记外泌体,发现在大鼠支气管上皮细胞中可以检测到PKH67标记的绿色荧光,提示大鼠支气管上皮细胞可以摄取大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体。PCR结果显示,miR-21-5p的表达水平在与经LPS刺激的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体共培养的大鼠支气管上皮细胞中更高（P<0.05）,GW4869可抑制这种升高。（3）Western blot检测提示,与LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体共培养的大鼠支气管上皮细胞表现为E-cadherin蛋白表达降低,α-SMA及Vimentin蛋白表达升高（P<0.05）,miR-21-5p inhibitor及GW4869可抑制这种改变。免疫荧光提示,与LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体共培养的大鼠支气管上皮细胞表现为α-SMA蛋白表达增多,miR-21-5p inhibitor及GW4869可抑制这种改变。3、LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p抑制大鼠支气管上皮细胞中的Smad7,激活TGF-β1/Smad7信号转导通路,促进大鼠支气管上皮细胞EMT。（1）生物信息学预测miR-21-5p靶基因是Smad7和TGFβRII。（2）Western blot检测结果显示,与PBS-8周组相比,大鼠哮喘气道重塑模型肺组织中TGF-β1、TGFβRII蛋白表达增加,Smad7蛋白表达下降（P<0.05）;PCR分析显示,与PBS-8周组相比,大鼠哮喘气道重塑模型肺组织中TGF-β1、TGFβRII m RNA表达增加,Smad7 m RNA表达下降（P<0.05）。（3）PCR检测各组大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p的表达情况验证miR-21-5p mimics/miR-21-5p inhibitor的体外转染,结果提示,与各自的对照组相比,转染miR-21-5p mimics的大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p的表达水平升高（P<0.05）,转染miR-21-5p inhibitor的大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p的表达水平下降（P<0.05）。转染miR-21-5p mimics的大鼠支气管上皮细胞中,Western blot检测TGF-β1/Smad7信号通路相关蛋白,结果表现为Smad7蛋白水平的降低,TGF-β1、TGFβRII,pSmad2,pSmad3蛋白增加（P<0.05）,转染miR-21-5p inhibitor后,表现出Smad7蛋白水平的升高,TGF-β1、TGFβRII,pSmad2,pSmad3蛋白降低（P<0.05）。Western blot检测大鼠支气管上皮细胞中上皮细胞及间质细胞相关标志物,结果表现为,转染miR-21-5p mimics的大鼠支气管上皮细胞中E-cadherin蛋白表达降低,α-SMA及Vimentin蛋白表达升高（P<0.05）,转染miR-21-5p inhibitor后,E-cadherin蛋白水平升高,α-SMA及Vimentin蛋白降低（P<0.05）。免疫荧光提示,转染miR-21-5p mimics的大鼠支气管上皮细胞表现为间质细胞标志物α-SMA蛋白表达增多。双荧光素酶报告基因实验证实了在大鼠支气管上皮细胞中miR-21-5p对Smad7的靶向结合抑制作用。（4）Western blot检测表明,经LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理的大鼠支气管上皮细胞中,Smad7蛋白水平降低,TGF-β1蛋白水平升高（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证实,LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p通过与Smad7 m RNA 3’UTR结合而抑制其在大鼠支气管上皮细胞中的表达。（5）将si NC或Smad7 siRNA转染的大鼠支气管上皮细胞暴露于源自LPS刺激预转染miR-21-5p inhibitor的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体,Western blot印迹结果表明,与LPS刺激的转染miR-21-5p inhibitor的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理si NC大鼠支气管上皮细胞这组相比,LPS刺激的转染miR-21-5p inhibitor的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体处理Smad7 siRNA大鼠支气管上皮细胞组中TGF-β1、α-SMA和Vimentin表达水平升高（P<0.05）。免疫荧光提示LPS刺激的转染miR-21-5p inhibitor的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体联合Smad7 siRNA处理组大鼠支气管上皮细胞中α-SMA表达水平升高。通过使用TGF-β1 siRNA下调大鼠支气管上皮细胞中TGF-β1的表达,可以阻止LPS刺激的大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体诱导的大鼠支气管上皮细胞中α-SMA和Vimentin的蛋白水平升高（P<0.05）。免疫荧光提示LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体联合TGF-β1 siRNA处理组大鼠支气管上皮细胞中α-SMA表达水平降低。研究结论:1、在大鼠哮喘气道重塑模型中,miR-21-5p主要定位于巨噬细胞中。MiR-21-5p表达水平的增高伴随气道上皮细胞EMT的表现。2、LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞引起其内miR-21-5p表达水平升高,且分泌的外泌体中miR-21-5p表达水平也升高。LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体可被大鼠支气管上皮细胞摄取,并通过外泌体转移miR-21-5p,引起大鼠支气管上皮细胞内miR-21-5p表达水平升高。LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体可促进大鼠支气管上皮细胞EMT,且可通过外泌体miR-21-5p发挥作用。3、LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞分泌的外泌体miR-21-5p通过靶向抑制大鼠支气管上皮细胞中Smad7的表达,诱导TGF-β1表达,从而促进大鼠支气管上皮细胞EMT。