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根瘤菌能与豆科植物特异的形成根瘤，植物通过光合作用为根瘤菌提供碳源，根瘤菌含有的固氮酶将空气中的氮还原从而为植物提供氮源。根瘤的发生起始于植物分泌的一种类黄酮化合物信号分子，这种信号分子作用于根瘤菌，促使根瘤菌分泌结瘤因子(Nod factor)，结瘤因子作为根瘤菌共生信号分子作用于寄主植物，引起植物一系列形态、生理生化变化而产生根瘤。结瘤因子受体1(Nod factor receptor1，NFR1)是从百脉根不结瘤突变株中分离得到的基因，它负责接受结瘤因子并将信号向下传递。NFR1的蛋白包括3个部分：N-端的膜外部分含有2个Lys-M结构域，负责结瘤因子的接受，中间含有跨膜结构(TM)，C-端的膜内部分含有磷酸激酶(Protein kinase)结构域。NFR1自发现以来，其下游的信号接收分子仍未探明。酵母双杂交是近年来发展起来研究蛋白质之间相互作用的技术，常用于蛋白之间作用的体内鉴定。为了弄清NFR1下游的信号流向，进一步阐明结瘤因子信号传递途径，我们构建了一个百脉根AD-cDNA文库，通过酵母双杂交技术，以NFR1为诱饵，在文库中找寻与NFR1相互作用的蛋白，为确定NFR1的信号传递相关基因提供候选者。
贫栽培养百脉根，接种后分2d，4d，6d，8d，12d分别收获根部组织。将收获的根部组织混合，提取总RNA。通过RT-PCR得到cDNA，在cDNA两端加上接头，与带有接头的线性化的质粒pGADT7-Rec共转化酵母菌株AH109，带有接头的cDNA和pGADT7-Rec在酵母细胞内通过同源重组而成环化质粒，cDNA插入片断整合到GAL4 AD之后，在酵母体内与GAL4 AD融合表达。在SD/-Leu培养基上筛选文库转化子，待转化子生长出5d后，以Freezing Medium(含25％(v/v)甘油的YPD)收集所有转化子，并分装为1ml/管，于-70℃保存。通过稀释平板计数，计算得到文库效率约为2×10<6>，达到了每3ug pGADT7-Rec质粒一百万个转化子的期望值.随机挑选部分文库菌落抽取质粒，以为AD Insert Screening引物做PCR，检查文库的空载率以及插入片断平均长度，空载率为12.5％，平均片段长度在1.5kb左右。通过血球计数板计数，所得文库的细胞浓度为2×10<7>个/ml，达到了酵母双杂交所需要的细胞浓度。
将NFR1的膜内激酶区域克隆到pGBKT7上作为诱饵质粒，再将诱饵质粒转化酵母菌株Y187。将含有诱饵质粒的Y187与文库菌AH109混合培养，Y187与AH109交配融合，通过报告基因的表达，在四缺培养基上筛选阳性克隆。初步筛选得到了120个克隆，将初筛得到的克隆在含X-Gal(80μg/ml)的四缺平板上复筛，得到80个变蓝的克隆，初步确定变蓝的菌落为阳性克隆。从阳性克隆中分离出AD质粒，以AD质粒为模版PCR扩增cDNA插入片断。将AD质粒与诱饵质粒pGBKT7-NFR1PK共转化AH109，进行回转验证。挑选部分克隆测序，得到数种未知基因。以2d，4d，6d，8d，未接种的百脉根根部和百脉根叶，茎提取RNA，通过稀释使RNA浓度一致，以Ubiquitin为内参，做RT-PCR，以确定这些未知基因在百脉根中的表达情况。这些未知基因为确定NFR1将信号在膜内的传向提供了可能的去向。