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第一部分:紫杉醇对卵巢癌细胞的作用及其浓度依赖机制探讨目的探讨不同浓度紫杉醇对卵巢癌细胞发挥抗癌效应的机制以及紫杉醇诱导G2/M期阻滞与纺锤体检测点蛋白Bub1的相关性。方法以50、10、1、0.1、0.01uM紫杉醇作用于人卵巢癌细胞系A2780,以未加药细胞作为对照组,采用流式细胞术检测不同浓度,不同时间紫杉醇作用下A2780细胞的周期分布变化情况。以50uM、1uM、0.01uM紫杉醇A2780细胞,作用时间依次为12、24、24小时,未加药细胞作为对照组,流式检测G2/M期阻滞情况,RT-PCR检测Bub1mRNA的表达差异;采用胸苷对A2780细胞进行同步化处理后,流式分析0.01uM紫杉醇对细胞周期的影响;Annexin V/PI双染流式细胞术分析50uM紫杉醇对细胞坏死的影响。结果(1)当紫杉醇浓度为10uM,1uM,0.1uM时,G2/M期细胞比例明显高于50uM(P<0.001),0.01uM组(P<0.001)。且1uM组阻滞可持续至72小时,50uM组36小时后即观察不到G2/M期阻滞,5nM组与未处理组相比始终未检测到G2/M期阻滞。(2)1uM处理组G2/M期细胞比例和Bub1mRNA的表达均明显高于另外两个浓度组和未处理细胞(3)A2780细胞经同步化处理后给予0.01uM紫杉醇,经过一个细胞倍增时间未观察到G0/G1期阻滞。(4)50uM处理组坏死细胞的比例明显高于1uM,0.01uM组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论不同浓度紫杉醇发挥抗癌效应的机制不同,紫杉醇诱导G2/M期阻滞与纺锤体检测点Bub1的表达呈正相关。第二部分:紫杉醇发挥抗癌效应依赖于纺锤体检测点蛋白Bub1目的探讨纺锤体检测点蛋白Bub1在紫杉醇诱导G2/M期阻滞和发挥抗癌效应中的作用。方法(1)以不同浓度紫杉醇分别作用于A2780和A2780/TS细胞,作用时间为24小时,采用流式细胞术分析细胞周期;通过MTT法检测细胞增殖情况,以1uM紫杉醇分别作用于A2780和A2780/TS细胞,作用时间为24,36,48小时,通过流式检测凋亡情况。(2)采用胸苷和紫杉醇分别将A2780和A2780/TS细胞阻滞在G1/S早期和G2/M期,A2780和A2780/TS作为配对细胞,采用western-blot比较两株细胞分别在对数生长期,G1/S期和G2/M期Bub1蛋白的表达差异。(3)构建Bub1的shRNA表达载体(Bub1-shRNA),采用RNA干扰技术封闭A2780细胞中Bub1的表达,运用RT-PCR和western-blot检测Bub1的封闭情况。(4) Bub1-shRNA瞬时转染A2780细胞,转染后给予紫杉醇,运用PI单染、流式分析细胞周期和中、晚期凋亡情况;Annexin V单染、流式分析早期凋亡情况;采用Hoechst 33342染色法检测有丝分裂指数。结果(1)A2780与A2780/TS细胞均在0.1-10uM的浓度范围内有高比例的G2/M期细胞含量,某些浓度下紫杉醇对前者诱导G2/M期阻滞的作用要强于后者(P1uM=0.045, P10uM=0.036)。MTT法检测和流式分析均证实A2780细胞对紫杉醇的敏感性明显高于A2780/TS细胞,(P0.01uM、P0.1uM、P1uM<0.001,P10uM=0.021;P24h、P36h、P48h<0.001)(2)A2780和A2780/TS细胞经1uM紫杉醇处理后,G2/M期细胞的比例和Bub1的表达均明显高于对照细胞。(3)在对数生长期,G1/S期和G2/M期,A2780细胞Bub1蛋白的表达均高于A2780/TS细胞。(4)RT-PCR,western-blot均显示转染Bub1-shRNA后,A2780细胞中Bub1蛋白的表达明显下调。(5)封闭A2780细胞Bub1的表达后,有丝分裂指数降低(p=0.022);G2/M期细胞比例减少,G0-G1期和S期细胞比例升高(PG2/M=0.018,PG0-G1=0.041,PS=0.024);紫杉醇诱导中、晚期凋亡的效应明显减弱(p=0.027),紫杉醇诱导早期凋亡的效应并不受影响(p=0.236);紫杉醇对A2780细胞的增殖抑制率明显减弱(P0.1uM=0.037,P1uM =0.041,P10uM=0.029)。结论紫杉醇通过Bub1相关纺锤体检测点信号通路诱导G2/M期阻滞;Bub1表达的下调可以导致紫杉醇耐药。