砷化物是人类确定致癌物,亚砷酸钠(NaAsO2)是砷元素在环境中存在的主要形式。长期摄入砷化物可引起多种癌症,其中主要是皮肤癌、肺癌和膀胱癌等,砷化物已被国际癌症研究机构(IARC)确认为人类确定(I类)致癌物。但由于砷化物致癌实验动物模型一直未能成功建立,导致其致癌机制研究长期滞后。近年来砷化物所致细胞恶性转化和DNA损伤及细胞凋亡的体外模型已被应用于其致癌机制研究。炎症微环境是肿瘤的一个重要形成要素,炎症微环境中的细胞因子能够诱导抑癌基因突变和表观遗传学改变从而引起细胞内环境紊乱最终导致肿瘤的发生和演进。肿瘤是在各种致瘤因素作用下,细胞本身遗传学或表观遗传学的内在改变和炎症微环境中的细胞因子的外在作用共同诱发和促进的。因此,研究砷对于炎症微环境调控的分子机制对于阐明其致癌机制具有重要意义。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)样特性获得参与了多种疾病,特别与恶性肿瘤的发生和发展有关。近年,虽然EMT和CSCs特性获得与肿瘤细胞恶性程度和转移关系及其分子机制的研究已成为热点,但对于EMT和CSCs特性获得在环境致癌物所致细胞恶性转化及致癌过程中的作用和分子机制的研究报道甚少。因此深入研究调控砷化物诱导EMT过程中CSCs特性获得在恶性转化过程中的作用及其分子机制对于寻找砷化物致癌的早期生物学标志及发现新的防治措施具有重要理论意义和实用价值。第一部分HIFs在亚砷酸钠所致细胞恶性转化和DNA损伤中的作用及分子机制目的:研究在正常氧浓度下,NaAsO2对缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)的调控机制,探索HIFs在NaAs02所致细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和凋亡中的作用。方法:本研究选取人支气管上皮(HBE)细胞进行研究,建立NaAsO2所致HBE细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和细胞凋亡模型;软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验检测细胞恶性程度,碱性彗星实验和Hochest染色实验检测细胞DNA损伤和凋亡;western blot和RT-PCR技术检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路及 HIFs 的表达情况;应用蛋白酶体抑制剂MG132联合NaAsO2处理,免疫共沉淀实验检测HIFs的蛋白泛素化情况;应用抑制剂,siRNA干涉和质粒转染技术探讨HIFs在NaAsO2所致细胞增殖和恶性转化及DNA损伤和凋亡中的作用。结果:1.亚砷酸钠对HBE细胞恶性转化和DNA损伤的影响用 0.0、1.0、5.0 和 10.0μM NaAsO2 处理 HBE 细胞 24 h,结果显示 1.0μM NaAsO2引起HBE细胞增殖明显升高,而10.0 μM NaAsO2引起HBE细胞增殖降低,且表现出明显DNA拖尾和细胞凋亡现象;选取0.0和1.0 NaAsO2慢性处理HBE细胞30代(约15周)。结果发现1.0μM NaAsO2慢性处理的HBE细胞能在软琼脂上形成集落,裸鼠皮下形成肿瘤,肿瘤组织病理学切片显示为低分化上皮样癌细胞。提示NaAsO2在低水平引起HBE细胞增殖和恶性转化;而在高水平则引起HBE细胞DNA损伤和凋亡。2.亚砷酸钠对HBE细胞MAPKs和HIFs的影响用 0.0、1.0、5.0 和 10.0 μM NaAsO2 处理 HBE 细胞 24 h,结果发现 1.0 μM NaAsO2 引起 HBE 细胞胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)和 HIF-2α 水平升高;10.0 NaAsO2 引起 HBE 细胞 c-Jun N-端激酶(c-Jun N-terminal kinases,p-JNK)和HIF-lα水平升高。结果说明低水平NaAsO2主要激活ERK信号通路和诱导HIF-2α水平升高,而高水平NaAsO2主要激活JNK信号通路和诱导HIF-1α水平升高。3.ERK调控HIF-2α在低水平亚砷酸钠所致HBE细胞p53功能抑制中的作用分别用0.0和10.0 μM ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125预处理HBE细胞3h后,再分别用0.0和1.0μM NaAsO2处理HBE细胞24 h,结果发现阻滞ERK激活能逆转1.0μM NaAsO2对HBE细胞HIF-2α蛋白的泛素化降解的抑制作用,从而使HIF-2α的水平降低;分别用0.0和1.0 μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代(约15周),结果发现p-p53水平在恶性转化HBE细胞中明显降低;进一步用0.0和1.0 μM NaAsO2处理HBE细胞3、6、12和24h后,结果发现随急性处理时间的延长,p-p53水平逐渐降低;用10.0 nM HIF-1α-siRNA、HIF-2α-siRNA和con-siRNA处理HBE细胞24 h后,再用0.0和1.0 μM NaAs02处理HBE细胞24 h,结果发现抑制HIF-2α水平可以阻止低水平NaAs02所致p-p53水平降低,说明低水平NaAsO2可抑制p53激活。4.ERK调控HIF-2α在低水平亚砷酸钠所致HBE细胞恶性转化中的作用分别用 10.0 nM HIF-1α-siRNA、HIF-2α-siRNA 和 con-siRNA 处理 HBE 细胞24 h后,再用0.0和1.0 μM NaAsO2处理HBE细胞24 h,结果发现抑制HIF-2α水平可以抑制低水平NaAsO2所致HBE细胞增殖;进一步用10.0 ERK抑制剂U0126处理HBE细胞3 h,转染HIF-2α质粒高表达HIF-2α后,再用0.0和1.0 μM NaAsO2处理HBE细胞24 h,结果发现抑制ERK的激活可以抑制低水平NaAs02所致HBE细胞增殖,而抑制ERK激活后再次高表达HIF-2α可逆转其对低水平NaAsO2所致HBE细胞增殖的抑制作用。说明ERK通过HIF-2α发挥其促进细胞增殖的作用;进一步用0.0和1.0 μM HIF-2α抑制剂Topotecan处理HBE细胞3 h后,再用0.0和1.0 μM NaAs02处理HBE细胞24～48 h,如此反复处理30代,结果发现抑制HIF-2α水平可阻止1.0 NaAsO2慢性处理30代所致HBE细胞增殖升高、软琼脂上克隆形成和裸鼠皮下形成肿瘤。说明HIF-2α在低水平NaAsO2所致HBE细胞增殖、恶性转化和致瘤性中具有重要作用。5.JNK调控HIF-1α在高水平亚砷酸钠所致DNA损伤和细胞凋亡中的作用分别用0.0和10.0 μM ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125预处理HBE细胞3 h后,再分别用0.0和10.0μM NaAs02处理HBE细胞24 h,结果发现阻滞JNK激活能逆转10.0 μMNaAsO2对HBE细胞HIF-1α蛋白的泛素化降解的抑制作用,从而使HIF-1α的表达水平降低;分别用0.0和10.0 μM JNK抑制剂SP600125处理HBE细胞3 h后,再用0.0和10.0μM NaAsO2处理HBE细胞24 h;发现阻滞JNK激活可抑制高水平NaAs02所致HBE细胞凋亡和促进DNA损伤;进一步转染HIF-1α质粒高表达HIF-1α后,发现抑制JNK所致的HBE细胞DNA损伤加重和细胞凋亡的抑制有所逆转。提示JNK通过调控HIF-1α表达在高水平NaAsO2所致HBE细胞DNA损伤和凋亡中具有重要作用。结论:NaAsO2在低水平引起HBE细胞增殖和恶性转化,而在高水平则引起HBE细胞DNA损伤和细胞凋亡;ERK通过抑制HIF-2α的泛素蛋白酶体降解从而诱导其高表达进而抑制p53功能在低水平NaAsO2所致HBE细胞增殖和恶性转化过程中发挥重要作用;JNK通过抑制HIF-1α的泛素蛋白酶体降解从而诱导其高表达在高水平NaAsO2所致HBE细胞DNA损伤和凋亡过程中发挥重要作用。第二部分 HIF-2α在亚砷酸钠诱导炎症反应所致EMT和CSCs特性获得及细胞恶性转化中的作用及分子机制目的:研究HIF-2α在NaAsO2诱导的炎性反应中的作用及相关机制以及炎性反应诱导的EMT及CSCs特性的获得在NaAsO2所致细胞恶性转化中的作用。方法:本研究建立在NaAsO2所致的HBE细胞的恶性转化模型上,应用酶联免疫吸附(ELISA)实验检测HBE细胞分泌炎性因子IL-6、IL-8的情况;软琼脂集落形成实验检测不同恶性程度的HBE细胞的恶性情况;western blot和PCR技术检测EMT和CSCs特性相关指标和STAT3的表达情况;应用免疫荧光实验检测E-cadherin和Vimentin的细胞定位情况;干细胞悬浮成球和侧群细胞实验验证CSCs特性;southwestern blot、报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验检测HIF-2α与Twistl和Bmil启动子区的结合情况;应用siRNA干涉和IL-6中和抗体技术探讨HIF-2α在NaAsO2所致的炎性反应以及炎性反应所致的EMT和肿瘤干细胞特性获得中的作用。结果:1.亚砷酸钠对HBE细胞炎症反应的影响用0.0和1.0μM NaAsO2分别处理HBE细胞3、6、12和24 h后,结果显示IL-6和IL-8表达和分泌水平显著升高;分别用0.0和1.0 μM NaAsO2慢性处理HBE细胞30代后,结果发现1.0 NaAsO2处理细胞10代时,引起HBE细胞IL-6和IL-8表达和分泌水平升高,且随NaAsO2处理时间延长,改变越明显,提示NaAsO2能够诱导HBE细胞炎症反应。2.亚砷酸钠慢性处理对HBE细胞发生EMT和CSCs特性获得的影响分别用0.0和1.0 NaAsO2慢性处理HBE细胞30代后,结果发现1.0μM NaAsO2处理细胞20代时细胞形态发生改变,上皮细胞指标E-cadherin水平降低,而间质细胞指标N-cadherin和vimentin水平升高,细胞发生了 EMT;发生了 EMT的恶性转化细胞中CD133和CD44的表达显著升高,其SP侧群细胞数显著上升,能够形成悬浮干细胞球,细胞具有了 CSCs特性。结果提示NaAsO2慢性处理诱导HBE细胞发生EMT和获得CSCs特性。3.HIF-2α直接调控Twist1和Bmi1在亚砷酸钠诱导的HBE恶性转化细胞EMT发生和CSCs特性获得中的作用用0.0和1.0μM NaAsO2分别处理HBE细胞6、12、和24 h后,Twist1和Bmi1表达水平明显升高;分别用0.0和1.0 μMNaAsO2慢性处理HBE细胞30代后,结果发现1.0 μM NaAsO2处理细胞10代时,Twist1和Bmi1水平明显升高,且随NaAsO2处理时间延长,改变越明显;分别转染Twist1和Bmi1报告基因质粒后,用0.0和1.0 μMNaAsO2分别处理HBE细胞24 h,结果发现HIF-2α可以与Twist1和Bmi1启动子区结合从而直接调控其表达。分别用0.0和1.0 μM HIF-2α抑制剂Topotecan预处理HBE细胞3 h后,再分别用0.0和1.0 NaAsO2处理HBE细胞24～48 h,如此重复处理30代。结果发现阻滞HIF-2α表达可抑制1.0 NaAsO2慢性处理所致HBE细胞E-cadherin水平下降及N-cadherin、vimentin、CD133和CD44水平升高,抑制细胞形态发生间质样改变。结果显示NaAsO2通过HIF-2α调控Twist1和Bmi1诱导HBE恶性转化细胞EMT发生和CSCs特性获得。4.亚砷酸钠对HBE细胞STAT3信号通路的影响用 0.0 和 1.0 μM NaAsO2分别处理 HBE 细胞 15、30 min 和 1、3、6、12、24 h后,STAT3能被NaAsO2瞬时激活,STAT3水平3h明显升高,并于12h达到高峰;分别用0.0和1.0 μM NaAs02慢性处理HBE细胞30代后,结果发现1.0μM NaAsO2处理细胞10代时,STAT3明显被激活,且随NaAsO2处理时间延长,STAT3处于持续激活状态;收集0.0和1.0 1μM NaAsO2慢性处理30代的HBE细胞培养液,分别作用于HBE细胞15、30、60 min后,发现慢性处理30代的HBE细胞培养液能够激活HBE细胞的STAT3水平;进一步应用0.5 μg/mL IL-6中和抗体阻滞IL-6后,细胞STAT3的水平显著降低。提示NaAsO2通过IL-6调控STAT3的激活从而发挥其调控炎症反应的作用。5.IL-6对亚砷酸钠诱导的HBE细胞发生EMT的影响用0.5 μg/mL IL-6中和抗体处理NaAsO2慢性处理的30代恶性转化HBE细胞后,发现阻滞IL-6可抑制1.0 μM NaAsO2慢性处理所致HBE细胞上皮细胞标志E-cadherin水平下降和间质细胞标志Vimentin和N-cadherin水平升高,抑制细胞形态发生间质样改变。提示IL-6信号通路在NaAsO2慢性处理所致HBE细胞EMT中具有重要作用。6.HIF-2αα通过炎性因子调控炎症反应对亚砷酸钠诱导的HBE细胞恶性转化的影响用 10.0 nM HIF-2α-siRNA 和 con-siRNA 处理 HBE 细胞 24 h 后,再用 0.0 和1.0μMNaAsO2处理HBE细胞24 h,发现抑制HIF-2α的表达后,由NaAsO2诱导的IL-6和IL-8的表达和分泌升高受到抑制;进一步用10.0 nM HIF-2α-siRNA和con-siRNA处理NaAsO2诱导的已恶性转化的30代HBE细胞,发现抑制HIF-2α的表达后,恶转30代的HBE细胞中高表达的IL-6和IL-8明显受到抑制。用 10.0 nM HIF-2α-siRNA 和 con-siRNA 处理 NaAsO2诱导的已恶转的 30 代HBE细胞后,加入10 ng/mL的人重组因子IL-6和IL-8处理24h后,发现抑制HIF-2α的表达进一步上调IL-6和IL-8的表达后,1.0 μMNaAsO2慢性处理30代恶性转化HBE细胞在软琼脂上形成集落数未发现明显的改变。进一步用10 ng/mL的人重组因子IL-6和IL-8处理正常HBE或1.0 NaAsO2慢性处理10代HBE细胞3d后,发现通过人重组因子IL-6和IL-8处理后而上调IL-6和IL-8的水平使1.0 μM NaAs02慢性处理10代HBE细胞在软琼脂上形成集落数明显升高;用0.5 μg/mL IL-6和IL-8中和抗体处理正常HBE或1.0μM NaAsO2慢性处理30代HBE细胞3d后,发现通过中和抗体处理而下调IL-6和IL-8的水平使1.0 μMNaAsO2慢性处理30代恶性转化HBE细胞在软琼脂上形成集落数明显降低。所有结果均说明HIF-2α通过调控IL-6和IL-8在NaAsO2诱导的HBE细胞恶性转化中发挥重要作用。结论:NaAsO2能够引起HBE细胞炎性因子IL-6和IL-8表达和分泌水平升高,诱导细胞发生炎症反应;在NaAsO2慢性处理所致HBE细胞恶性转化过程中发生EMT和CSCs特性获得;HIF-2α直接调控Twist1和Bmi1在NaAsO2慢性处理所致HBE细胞EMT和CSCs特性获得中发挥重要作用;NaAsO2通过IL-6调控STAT3的激活从而在NaAsO2诱导的炎性反应中发挥作用;HIF-2α通过调控炎性反应诱导EMT在NaAsO2所致HBE细胞恶性转化中发挥重要作用。第三部分HIFs在亚砷酸钠诱导小鼠肺部炎症反应中的作用目的:研究不同水平NaAsO2亚慢性处理ICR小鼠对其肺部炎症反应的影响,探索HIFs在NaAsO2致小鼠炎症反应中的作用。方法:本研究选取ICR小鼠进行研究,建立不同水平NaAsO2亚慢性处理所致ICR小鼠肺部炎症反应的动物模型;病理组织切片HE染色观察小鼠肺部炎症改变;小鼠支气管肺泡灌洗实验检测肺部炎性细胞浸润情况;ELISA和PCR技术检测小鼠肺部和血清炎性因子变化;western blot和免疫组化实验检测小鼠肺部HIFs的表达情况;应用Pearson法进行HIFs和炎性因子IL-6的相关性分析探讨HIFs在NaAsO2所致小鼠炎症反应中的作用。结果:1.不同水平亚砷酸钠对ICR小鼠炎症反应的影响ICR小鼠分别采用饲料喂饲和自由饮用含0、50、100和200 μM NaAsO2的饮水3个月,建立不同水平NaAsO2饮水型砷中毒的小鼠动物模型后,结果发现实验组小鼠肺泡腔内可见明显的出血和炎性渗出,其肺部发生明显的炎症反应;小鼠血清中炎性因子IL-6和TNF-α水平显著升高;支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数均显著高于正常对照组;且小鼠肺部炎性因子IL-6、IL-8和TNF-α表达水平显著升高。结果均显示不同水平NaAsO2处理能够诱导小鼠发生炎症反应。2.不同水平亚砷酸钠对ICR小鼠肺部HIFs表达的影响ICR小鼠分别采用饲料喂饲和自由饮用含0、50、100和200 μM NaAsO2的饮水3个月,建立不同水平NaAsO2饮水型砷中毒的小鼠动物模型后,结果发现实验组小鼠肺组织中HIF-1α和HIF-2α表达水平均升高,说明NaAsO2处理能够诱导小鼠肺组织中HIF-1α和HIF-2α高表达。3.不同水平亚砷酸钠处理小鼠肺部HIFs表达和炎性因子相关性分析ICR小鼠分别采用饲料喂饲和自由饮用含0、50、100和200 μMNaAsO2的饮水3个月,建立不同水平NaAsO2饮水型砷中毒的小鼠动物模型后,结果显示肺组织中HIF-1α和HIF-2α与IL-6分别存在线性相关关系,说明NaAsO2诱导的小鼠肺部炎症反应中,IL-6与HIF-1α和HIF-2α的表达存在正相关。结论:不同水平NaAsO2亚慢性处理能够引起ICR小鼠的肺部炎症反应;不同水平NaAsO2均可诱导小鼠肺组织中HIF-1α和HIF-2α表达水平升高,且升高的HIF-1α和HIF-2α的表达与IL-6水平存在正相关。综上所述,本研究主要发现:1.NaAsO2在低水平引起HBE细胞增殖和恶性转化;而在高水平则引起HBE细胞DNA损伤和细胞凋亡。2.低水平NaAsO2激活ERK抑制HIF-2α的泛素蛋白酶体降解而诱导其水平升高,而高水平的HIF-2α抑制p53功能在NaAsO2所致HBE细胞增殖和恶性转化过程中具有重要作用。3.高水平NaAsO2激活JNK抑制HIF-1α的泛素蛋白酶体降解而诱导其水平升高,而高水平的HIF-1α在高水平NaAsO2所致HBE细胞DNA损伤和凋亡中具有重要作用。4.HIF-2α直接作用于Twist1和Bmi1启动子区调控NaAsO2慢性处理所致HBE细胞EMT和CSCs特性获得。5.HIF-2α通过调控NaAsO2所致炎症反应在HBE细胞EMT和CSCs特性获得及恶性转化过程中具有重要作用。6.HIF-1α和HIF-2α在NaAsO2亚慢性处理诱导小鼠肺部炎症反应中水平均升高,且HIF-1α及HIF-2α水平升高与炎性因子IL-6水平正相关。