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五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)是一种应用现代技术合成的新型抗脑梗药物。其在体内主要代谢产物为二肽。本研究基于五肽的在SD大鼠和Beagle犬体内的药代动力学基础上,应用微透析结合LC-MS/MS方法,研究五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其主要代谢产物二肽(Asn-Ser)的临床前药代动力学,为进一步开展临床研究提供参考。一、微透析探针的制备及其体外回收率的考察本文完成了微透析探针的研制,考察了探针的体外回收率,实验结果表明体内回收率可采用反透析法,探针回收率与灌流液流速成反比,与溶媒中药物浓度无关,五肽探针回收率在120min内基本保持稳定,本研究为微透析技术应用于创新药物五肽体内药代动力学研究提供了实验依据。二、生物样品中五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其主要代谢产物二肽(Asn-Ser)定量分析方法的建立及确证本文建立了透析液样品中五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的LC-MS/MS测定方法,微透析样品无需复杂前处理。色谱柱：Hanbon Hedera CN柱,5μm,1004.6mm,柱温25℃；流动相组成甲醇：水(含0.1%甲酸)=60:40(V：V),等度洗脱,流速0.5mL/min,进样时间3min,进样量10μL。采用ESI离子源、正离子检测,MRM模式进行质谱分析。所有微透析样品的专属性、准确度、精密度、线性范围、基质效应、稳定性等均达到生物样品定量分析的要求。该方法成功应用于SD大鼠血液透析液样品、脑部透析液样品和Beagle犬血液透析液样品的药代动力学研究。三、五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其主要代谢产物二肽(Asn-Ser)在SD大鼠血液透析液和脑部透析液的药代动力学研究本实验研究了SD大鼠单剂量静脉推注给药PEP-801溶液0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg(以五肽Met-Gln-Cys-Asn-Ser计)后SD大鼠血液微透析药代动力学。采用LC-MS/MS法分别测定了3组SD大鼠给药后不同时间段血液透析液中五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的浓度,经探针回收率校正和非房室模型法估算得到SD大鼠体内五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的药动学参数。SD大鼠体内五肽游离浓度药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间(MRT)、单剂量静脉推注给药最大血药浓度(Cmax)、全身清除率(ClT)、表观分布容积(VD)、AUC0～τ、AUC0～∞分别为1.92±0.23min、2.27±0.35min、2.09±0.30min,6.62±0.17min、6.84±0.18min、6.68±0.08min,176.85±9.62ng/mL、282.45±29.07ng/mL、556.27±26.41ng/mL,0.27±0.02L/min/kg、0.33±0.02L/min/kg、0.33±0.01L/min/kg,1.76±0.13, L/kg、2.23±0.17L/kg、2.21±0.06L/kg,1831.11±132.68ng·min/mL、3008.2±202.14ng·min/mL、6005.73192.46ng·min/mL,1888.21±148.32ng-min/mL、3080.88±191.99ng·min/mL.6058.71±182.61ng-min/mL。SD大鼠体内五肽代谢产物二肽游离浓度药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间(MRT)、单剂量静脉推注给药最大血药浓度(Cmax)、全身清除率(ClT)、表观分布容积(VD)、AUC0～τ、AUC0～∞分别为4.31±0.42min.4.38±0.67min.6.33±0.45min,8.29±0.27min、8.14±0.08min、8.04±0.10min,241.44±8.74ng/mL,349.61±18.31ng/mL、705.7±30.59ng/mL0.19±0.01L/min/kg、0.22±0.01L/min/kg、0.23±0.01L/min/kg,1.54±0.12L/kg.1.83±0.05L/kg、1.85±0.08L/kg,2613.94±149.23ng-min/mL、4397.25±141.28ng-min/mL、8596.52±278.4ng-min/mL,2705.15±156.71ng-min/mL、4449.54±149.96ng-min/mL、8693.46±279.48ng-min/mL.五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其代谢产物二肽在SD大鼠体内血液微透析药代动力学规律与给药剂量线性相关,符合线性药代动力学特征。本实验研究了SD大鼠单剂量静脉推注给药PEP-801溶液2mg/kg(以五肽Met-Gln-Cys-Asn-Ser计)后SD大鼠脑部微透析药代动力学。采用LC-MS/MS法测定了SD大鼠给药后不同时间段脑部透析液中五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的浓度,结果表明在单剂量静脉推注给药PEP-80l溶液2mg/kg(以五肽Met-Gln-Cys-Asn-Ser计)过程中(10min时间段)以及推注后2min时间段内,脑部(透析液中)均存在着一定浓度的五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)药效成分,但五肽脑部透析液中浓度相对于血液透析液中五肽浓度较低,同时未检出五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)代谢产物二肽(Asn-Ser)。经探针回收率校正和非房室模型法估算得到SD大鼠脑部五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)的药动学参数。SD大鼠脑部五肽游离浓度药时曲线的单剂量静脉推注给药脑部最大药物浓度(Cmax)、平均驻留时间(MRT)、全身清除率(ClT)、表观分布容积(VD)、AUC0～τ分别为54.81±3.11ng/mL、20.53±4.40min、1.84±0.25L/min/kg.36.96±1.69L/kg、467.48±12.58ng·min/mL。四、五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其主要代谢产物二肽(Asn-Ser)在Beagle犬血液透析液的药代动力学研究本实验研究了Beagle犬单剂量静脉推注给药PEP-801溶液0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg(以五肽Met-Gln-Cys-Asn-Ser计)后Beagle犬血液微透析药代动力学。采用LC-MS/MS法分别测定了3组Beagle犬给药后不同时间段血液透析液中五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的浓度,经探针回收率校正和非房室模型法估算得到Beagle犬体内五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的药动学参数。Beagle犬体内五肽游离浓度药时曲线的末端相消除半衰期(t1/2)、平均驻留时间(MRT)、单剂量静脉推注给药最大血药浓度(Cmax)、全身清除率(ClT)、表观分布容积(VD)、AUC0～τ、AUC0～∞分别为2.76±0.17min、2.18±0.21min、2.17±0.18min,17.43±0.19min、17.22±0.17min、17.57±0.00min,81.08±6.88ng/mL、142.44±4.65ng/mL、252.00±7.13ng/mL,0.09±0.01L/min/kg、0.1±0.00L/min/kg、0.12±0.00L/min/kg,1.54±0.11L/kg、1.73±0.05L/kg、2.17±0.07L/kg,2223.7±147.02ng·min/mL、3941.57±124.1ng·min/mL、6452.32±166.76ng·min/mL,2274.22±141.33ng·min/mL、3974.67±132.72ng·min/mL、6484.11±168.43ng·min/mL。Beagle犬体内五肽代谢产物二肽游离浓度药时曲线的末端相消除半衰期(tl/2)、平均驻留时间(MRT)、单剂量静脉推注给药最大血药浓度(Cmax)、全身清除率(ClT)、表观分布容积(VD)、AUC0～τ、AUC0～∞分别为3.56±0.17min、5.62±0.38min、7.32±0.77min,20.59±0.6119.97±0.2min、20.18±0.43min,124.78±9.82ng/mL、179.68±15.12ng/mL、276.85±2.76ng/mL,0.06±0.01L/min/kg、0.08±0.00L/min/kg、0.1±0.00L/min/kg,1.18±0.16L/kg、1.56±0.06L/kg、2.03±0.08L/kg,3444.4±333.91ng·min/mL、5033.76±227.54ng·min/mL、7848.42±200.36ng·min/mL,3512.9±337.41ng·min/mL、5117.61±230.66ng·min/mL、7945.58±188.33ng·min/mL。五肽(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其代谢产物二肽在Beagle犬体内血液微透析药代动力学规律与给药剂量线性相关,符合线性药代动力学特征。