研究背景卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)是引起妇科恶性肿瘤患者死亡最多的疾病,约占新发死亡的50%。尽管细胞减灭术及铂类药物治疗等有效治疗方法已经广泛应用于卵巢癌的治疗,卵巢癌的5年生存率并未得到明显改善,卵巢癌的高转移率依然导致了卵巢癌患者的高复发率及死亡率。基于监测、流行病学及预后项目(SEER 18 2006-2012,Surveillance,Epidemiology,and End Results Program),美国国家肿瘤中心报道,FIGO Ⅰ期卵巢癌患者5年生存率可高达92.1%,然而,75%的患者诊断时已经发生远处转移,5年生存率锐减至17%(FIGO Ⅳ期)。因此,深入理解并寻找可以抑制卵巢癌侵袭转移的分子机制,有助于提高卵巢癌患者的治疗有效率及改善患者预后。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),是一种发育调控性编程,可将已分化上皮细胞转化成未分化具有迁移能力的间质细胞,从而影响胚胎发育、创口愈合及肿瘤转移。EMT可促使肿瘤细胞脱离原发位置,侵袭周围组织及血管,进而发生转移。研究证实,上皮间质转化(EMT)同样参与卵巢癌侵袭转移的启动。更重要的是,当肿瘤细胞发生侵袭转移时,EMT还可诱导肿瘤细胞获得干细胞特性,发生耐凋亡、免疫豁免等,进一步促进肿瘤的侵袭转移,增加治疗难度。因此,寻找阻断上皮间质转化过程的分子或信号通路对抑制卵巢癌的侵袭转移具有重要意义。自噬(Autophagy)是生物体内一种高度保守的生物学行为,对维持细胞的生理稳态具有重要意义。它通过形成自噬小体包裹蛋白质、脂质、糖类、核酸甚至细胞器以及病原体,并传递自噬小体与溶酶体结合,完成自噬过程,以实现细胞内老旧细胞器的代谢及免疫防御。近年来,研究发现,自噬与肿瘤的侵袭转移关系密切。自噬可通过调节上皮间质转化(EMT)转录因子Snail、Slug、Twist影响EMT过程,从而影响肿瘤的侵袭转移。在胆管癌、肝细胞癌中自噬可通过激活EMT,促进肿瘤的侵袭转移;而在神经胶质瘤中自噬可通过逆转EMT抑制肿瘤的侵袭转移。目前,自噬是否通过EMT参与卵巢癌的侵袭转移尚无研究报道。血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)属于热休克蛋白,分子量为32Kda。HO-1分子最初作为血红素降解的限速酶被发现。HO-1不仅参与血红素的降解,同时是细胞内重要的信号分子,参与多种氧化应激的应答,包括低氧、活性氧簇ROS、重金属、紫外线等,维持细胞稳态。研究表明,HO-1过表达在多种肿瘤中被证实,包括前列腺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、神经胶质瘤等,并与患者的不良预后、肿瘤期别相关。同时,HO-1分子与肿瘤的增殖、血管形成、化疗敏感性及远处转移密切相关。目前,HO-1分子与卵巢癌的关系尚无研究报道。本研究首次探讨了自噬与卵巢癌细胞侵袭转移的关系,并进一步研究了ROS/HO-1通路参与自噬缺陷诱导的卵巢癌细胞上皮间质转化的机制及HO-1分子在卵巢癌中表达的临床意义。第一部分自噬抑制卵巢癌细胞发生迁移、侵袭的作用及机制研究研究目的:1.检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3自噬水平及迁移侵袭能力。2.探讨自噬对卵巢癌细胞A2780、Skov-3迁移侵袭能力的影响及其作用机制。研究方法:应用Western blotting方法检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3自噬相关蛋白Beclin-1、P62、LC3 及上皮间质转化相关蛋白 Keratin、Vimentin、N-cadherin、Zebl表达水品;应用Transwell小室检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3的迁移侵袭能力;应用细胞免疫荧光检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3上皮表型蛋白Keratin及间质表型蛋白Vimentin的表达情况;应用EBSS(Earle’ s Balanced Salt Solution)溶液及Rapamycin诱导自噬,Chloroquine抑制自噬;应用CCK-8方法检测EBSS及Rapamycin诱导自噬后细胞的活性。研究结果:1.A2780、Skev-3细胞形态、自噬水平及迁移侵袭能力的检测及意义:应用显微镜观察A2780、Skov-3细胞形态,结果显示:A2780细胞表现为类圆形形态,Skov-3细胞则表现为成纤维样细胞形态;应用Transwell小室检测A2780、Skov-3细胞迁移侵袭能力,结果显示:与A2780细胞相比,Skov-3细胞具有较强的迁移侵袭能力(P<0.01);应用Western blotting检测A2780、Skov-3细胞内蛋白表达水平,结果显示:与A2780细胞相比,Skov-3细胞低表达上皮表型蛋白Keratin及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ,高表达间质表型蛋白Vimentin及N-cadherin、转录因子蛋白Zeb1、自噬相关蛋白P62(P<0.01)。2.自噬对A2780、Skov-3细胞增殖能力的影响:应用CCK-8方法检测自噬激活剂(EBSS、20nM Rapamycin)对A2780、Skov-3细胞增殖能力的影响,结果显示:自噬对细胞增殖抑制作用具有时间依赖性(P<0.05)。早期细胞可短暂增殖(3h时间点);至6h后细胞增殖受到抑制;至24h,细胞的生存率:EBSS:A2780:86.8%±2.6%,Skov-3:88.8%±4.3%;Rapamycin:A2780:89.0%±2.9%,Skov-3:91.3%±3.6%;至观察的终止时间点48h,细胞生存率依然高达70%以上。3.自噬对A2780、Skov-3细胞上皮间质转化的影响:应用Western blotting检测自噬激活剂(EBSS)对A2780、Skov-3细胞蛋白表达水平的影响,结果显示:激活自噬后,细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,Beclin-1表达增加,P62表达下降(P<0.01);同时,间质表型蛋白Vimentin、N-cadherin及转录因子蛋白Zeb1表达下降,上皮表型蛋白Keratin表达上升(P<0.05)。免疫荧光结果显示:细胞内绿色荧光标记的上皮表型蛋白Keratin表达增强,红色荧光标记的间质表型蛋白Vimentin表达减弱。4.抑制自噬对A2780、Skov-3细胞上皮间质转化及迁移侵袭能力的影响:应用自噬抑制剂(Chloroquine)抑制细胞内已被自噬激活剂(EBSS、Rapamycin)激活的自噬。应用Western blotting检测自噬抑制剂(20 μMChloroquine)对已经激活自噬的A2780、Skov-3细胞自噬相关蛋白P62、LC3表达水平的影响,结果显示:加入自噬抑制剂Chloroquine后,与自噬激活组相比较,细胞内P62表达升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.01)。结果表明,Chloroquine抑制了已经被激活的自噬。应用Transwell小室检测自噬抑制剂(20 μM Chloroquine)对已经激活自噬的A2780、Skov-3细胞迁移侵袭能力的影响,结果显示:加入自噬抑制剂Chloroquine后,与自噬激活组相比较,原本被抑制的迁移侵袭能力逆转,细胞的迁移侵袭能力增强(P<0.01)。应用Western blotting检测自噬抑制剂(20 μM Chloroquine)对已经激活自噬的A2780、Skov-3细胞上皮间质转化相关蛋白Keratin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1表达水品的影响,结果显示:加入自噬抑制剂Chloroquine后,与自噬激活组相比较,细胞内原本下调的间质表型蛋白Vimentin、N-cadherin及转录因子蛋白Zeb1表达再次上调,上调的上皮表型蛋白Keratin表达再次下调(P<0.01)。研究结论:1.卵巢癌细胞的自噬水平与细胞的迁移侵袭能力相关。2.自噬可通过抑制上皮间质转化抑制卵巢癌细胞的迁移侵袭。第二部分ROS/HO-1通路调控自噬缺陷诱导的卵巢癌细胞上皮间质转化的机制研究研究目的:1.探讨自噬缺陷对卵巢癌细胞A2780、Skov-3迁移侵袭能力的影响。2.探讨自噬缺陷对卵巢癌细胞A2780、Skov-3上皮间质转化的影响及其机制。研究方法:应用Western blotting方法检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3自噬相关蛋白Atg7、P62、LC3,上皮间质转化相关蛋白 Keratin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1表达水品及HO-1分子表达;应用Transwell小室检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3的迁移侵袭能力;应用siRNA干扰卵巢癌细胞A2780、Skov-3中Atg7分子的表达,构建自噬缺陷细胞;应用细胞流式技术检测细胞内R0S表达水平;应用N-acetylcysteine(NAC)清除 ROS 表达,Zinc-protoporphyrin(Znpp)抑制HO-1表达。研究结果:1.沉默Atg7表达及A2780、Skov-3细胞自噬缺陷模型的构建:应用siRNA干扰 A2780、Skov-3 细胞 Atg7 分子表达,应用 Western blotting 检测 A2780、Skov-3细胞自噬相关蛋白P62、LC3表达水平,结果显示:与对照组相比,Atg7 siRNA组A2780、Skov-3细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降,同时伴有P62表达升高(P<0.05)。表明细胞存在自噬缺陷,成功构建了自噬缺陷模型:A2780 Atg7siRNA及 Skov-3 Atg7siRNA 细胞。2.自噬缺陷对A2780、Skov-3细胞上皮间质转化及迁移侵袭能力的影响:应用Transwell小室检测Atg7 siRNA(自噬缺陷)组、NC组及空白对照组细胞的迁移侵袭能力,结果显示:自噬缺陷细胞的迁移侵袭能力明显高于对照组细胞(P<0.01)。应用 Western blotting 检测 Atg7 siRNA(自噬缺陷)组、NC 组及空白对照组细胞上皮间质转化相关蛋白Keratin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1的表达水品,结果显示:与对照组相比,自噬缺陷细胞中,间质表型蛋白Vimentin、N-cadherin及转录因子蛋白Zeb1表达增强,伴有上皮表型蛋白Keratin 表达下降(P<0.01)。3.自噬缺陷对A2780、Skov-3细胞内ROS表达及HO-1分子表达的影响:应用流式细胞术检测Atg7 siRNA(自噬缺陷)组、NC组及空白对照组细胞内ROS的表达,结果显示:与对照组相比,自噬缺陷细胞内ROS水平明显升高。应用Western blotting检测Atg7 siRNA(自噬缺陷)组、NC组及空白对照组细胞内HO-1分子的表达,结果显示:与对照组相比,自噬缺陷细胞中,HO-1分子表达明显增加(P<0.01)。4.ROS调控自噬缺陷诱导的卵巢癌细胞上皮间质转化及HO-1分子表达的机制研究:应用ROS清除剂NAC降低自噬缺陷细胞内ROS水平。应用Transwell小室检测10mM NAC对自噬缺陷细胞迁移侵袭能力的影响,结果显示:NAC处理后,自噬缺陷细胞的迁移侵袭能力明显受到了抑制(P<0.001)。应用Western blotting检测10mM NAC对自噬缺陷细胞上皮间质转化相关蛋白Keratin、Vimentin、N-cadherin、Zebl及HO-1蛋白表达水平的影响,结果显示:NAC处理后,自噬缺陷细胞的上皮表型蛋白Keratin表达增加,间质表型蛋白Vimentin、N-cadherin及转录因子蛋白Zebl表达下降(P<0.05)。此外,NAC明显抑制了自噬缺陷细胞HO-1分子表达(P<0.001)。5.HO-1调控自噬缺陷诱导的卵巢癌细胞上皮间质转化的机制研究:应用HO-1抑制剂Znpp抑制自噬缺陷细胞内HO-1表达。应用Transwell小室检测10μMZnpp对自噬缺陷细胞迁移侵袭能力的影响,结果显示:Znpp处理后,自噬缺陷细胞的迁移侵袭能力明显受到了抑制(P<0.01)。应用Western blotting检测10 μM Znpp对自噬缺陷细胞上皮间质转化相关蛋白Keratin、Vimentin、N-cadherin、Zebl表达水平的影响,结果显示:Znpp处理后,自噬缺陷细胞的上皮表型蛋白Keratin表达增加,间质表型蛋白Vimentin、N-cadherin,转录因子蛋白Zebl表达明显下降(P<0.01)。研究结论:1.自噬缺陷增强卵巢癌细胞的迁移侵袭能力。2.自噬缺陷诱导卵巢癌细胞发生上皮间质转化。3.HO-1通过ROS/HO-1通路参与自噬缺陷诱导的卵巢癌细胞上皮间质转化过程。第三部分HO-1在卵巢癌组织中的表达及对生物学行为的影响研究目的:1.检测HO-1在卵巢癌组织中的表达情况。2.分析HO-1表达与卵巢癌临床病理特征及预后的相关性。3.探讨HO-1对卵巢癌生物学行为的影响。研究方法:应用免疫组织化学方法检测卵巢癌201例(浆液性卵巢癌117例,粘液性卵巢癌16例,内膜样卵巢癌25例,透明细胞卵巢癌21例,其他类型卵巢癌22例)组织中HO-1的表达;应用X2检验/Fisher’ s检验分析检测HO-1表达与临床病理特征的关系;完成手术治疗及6次铂类为基础的化学治疗的150例患者纳入随访统计,应用Kaplan-Meier曲线及Log-rank检验分析HO-1表达与卵巢癌患者预后的关系;应用Western blotting方法检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3上皮间质转化相关蛋白Keratin、Vimentin、Zebl及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax分子表达;应用Transwell小室检测卵巢癌细胞A2780、Skov-3的迁移侵袭能力;应用CCK-8检测细胞活性;应用Zinc-protoporphyrin(Znpp)抑制HO-1表达,Hemin诱导HO-1表达。研究结果:1..HO-1分子在卵巢癌组织中的表达情况:应用免疫组织化学方法检测卵巢癌组织切片201例(浆液性卵巢癌117例,粘液性卵巢癌16例,内膜样卵巢癌25例,透明细胞卵巢癌21例,其他类型卵巢癌22例)中HO-1分子的表达情况,结果显示:HO-1分子主要表达于组织的细胞浆。此外,HO-1分子在不同病理类型卵巢癌组织中表达存在差异:在浆液性卵巢癌中高表达(P=0.0359),在粘液性卵巢癌中则低表达(P=0.0124)。2.HO-1分子在卵巢癌组织中的表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系:HO-1分子高表达与浆液性卵巢癌(OR=1.859,95%CI=1.038-3.327),高临床FIGO分期(OR=3.656,95%CI=1.602-8.344),淋巴结转移(OR=7.779,95%CI=2.280-26.540),及不满意的肿瘤细胞减灭术(OR=4.464,95%CI=2.137-9.323)密切相关。同时,HO-1分子低表达与粘液性卵巢癌(OR=0.235,95%CI=0.078-0.705)密切相关。HO-1分子表达与患者年龄及肿瘤分化程度并未发现明显相关性。3.HO-1分子在卵巢癌组织中的表达与卵巢癌患者预后相关性:在随访期内,HO-1低表达卵巢癌患者中49例出现22例死亡,HO-1高表达卵巢癌患者中101例发生63例死亡;HO-1低表达卵巢癌患者中位生存期为59个月,HO-1高表达卵巢癌患者中位生存期为36个月。Kaplan-Meier曲线及log-rank检验用来分析HO-1表达与卵巢癌患者预后的关系,结果显示:HO-1高表达卵巢癌患者比HO-1低表达卵巢癌患者预后差(HR=1.639,95%CI= 1.023-2.254),差异有统计学意义(P=0.0002)。4.HO-1分子对卵巢癌生物学行为的影响:应用HO-1分子诱导剂Hemin及HO-1分子抑制剂Znpp处理卵巢癌细胞A2780、Skov-3.应用CCK-8检测HO-1对卵巢癌细胞增殖的影响,结果显示:Hemin促进细胞增殖具有时间和浓度依赖性(P<0.05),Znpp抑制细胞增殖具有时间和浓度依赖性(P<0.05)。应用Transwell小室检测HO-1分子对卵巢癌细胞迁移侵袭能力的影响,结果显示:Hemin明显促进细胞的迁移侵袭(P<0.01),Znpp抑制细胞的迁移侵袭(P<0.05);Znpp与Hemin共同培养细胞后,Znpp抑制了 Hemin对细胞的促迁移侵袭作用(P<0.01)。应用Western blotting检测HO-1对卵巢癌细胞蛋白表达的影响,结果显示:Hemin促进细胞间质表型蛋白Vimentin、转录因子蛋白Zebl及抗凋亡蛋白Bcl-2表达,抑制上皮表型蛋白Keratin及促凋亡蛋白Bax表达(P<0.05);Znpp抑制细胞间质表型蛋白Vimentin、转录因子蛋白Zebl及抗凋亡蛋白Bcl-2表达,促进上皮表型蛋白Keratin及促凋亡蛋白Bax表达(P<0.05);Znpp与Hemin共同培养细胞后,Znpp逆转了 Hemin对上皮间质转化相关蛋白及凋亡相关蛋白的影响(P<0.05)。研究结论:1.HO-1分子在卵巢癌组织中高表达与卵巢癌的高FIGO临床分期、淋巴结转移密切相关,表明HO-1分子参与了卵巢癌的发生发展过程。2.HO-1分子在卵巢癌组织中的高表达影响卵巢癌患者的预后,是预测卵巢癌预后的分子学标志物。3.HO-1可以通过抑制卵巢癌细胞的凋亡、促进上皮间质转化过程,以增强卵巢癌细胞的增殖及迁移侵袭能力。