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蛋白酶pyrolysin是来源于超嗜热古菌Pyrococcus furiosus且与细胞外层结构相结合的超嗜热蛋白酶。蛋白酶pyrolysin是一个典型的超嗜热蛋白酶,其最适反应温度是115℃,在高温条件下具备良好的稳定性,在E.coli表达得到的重组酶95℃的半衰期约为12 h,从原始菌株P.furiosus中分离得到的蛋白酶pyrolysin 100℃的半衰期约为4 h。蛋白酶pyrolysin具备如此优良的高温稳定性使其不仅在P.furiosus中发挥着重要的生理功能,同时也在工业生产中有着广阔的应用前景。对蛋白酶来说,稳定性在其进化过程和工业应用中都至关重要,研究人员往往需要寻找稳定性较好的蛋白酶或对现有的蛋白酶进行改造来满足工业生产的需要。提高蛋白酶的稳定性通常有定向进化和理性设计两种方法,其中理性设计包括经验理性设计和系统理性设计。利用经验理性设计主要是对蛋白酶的活性位点附近残基进行突变,同时也借鉴其它嗜热蛋白酶的改造经验;系统理性设计主要是利用一些蛋白质稳定性预测软件,这些软件可以快速地预测出点突变对蛋白酶稳定性的影响,然后对预测出的突变体进行实验验证。为了进一步提高超嗜热蛋白酶pyrolysin的稳定性,本研究采用经验理性设计和系统理性设计两种方法,我们成功构建了稳定性提高的单点突变体N311P、I338A、N907V和N907M等。我们将这些单点突变体进行组合得到了稳定性进一步提高的双点突变体N311P/N907M,同时我们将突变体N311P/N907M与本实验室早期构建的稳定性提高的突变体D818N/D820N和突变体R249E/D818N/D820N进行组合,获得了 3个稳定性显著提高的突变体,分别是突变体 N311P/N907M/R249E、N311P/N907M/D818N/D820N 和突变体N311P/N907M/R249E/D818N/D820N。我们通过比较95℃保温后的残余活性以及在高于100°C温度的稳定性测定,系统地比较了这些组合突变体稳定性的差异。同时,我们也比较了在含有尿素、SDS和EDTA时这些突变体稳定性的差异,结果表明,新构建的3个组合突变体均具备较好的稳定性,其中稳定性最好的是突变体N311P/N907M/R249E/D818N/D820N,该突变体95°C保温12 h后的残余活性由野生型的50%左右提高到了 90%,这一结果也明显高于本实验室前期构建的稳定性提高的突变体R249E/D818N/D820N,其残余活性为76%。本研究为其它蛋白酶尤其是超嗜热蛋白酶的改造提供了经验,同时也为蛋白酶pyrolysin的工业应用奠定了基础。