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当今社会,转基因作物被人们普遍关注,而关于转基因食品的安全性问题的争论也从未停止。但是,由于食品加工品经历了一系列加工工艺的处理,其DNA发生不同程度的降解,而目前转基因成分检测主要是基于DNA的PCR技术,从而给食品加工品中转基因成分的检测带来了一定的困难,极易造成假阴性的检测结果。本文主要研究内容及结果如下:1.小片段DNA的回收本实验中比较了6种常用的提取DNA的方法,确定了QIAEX II Gel Extraction Kit试剂盒中硅珠回收小片段DNA效果最佳,然后进一步对硅珠回收小片段DNA的实验条件进行优化,最终确定了小片段DNA回收的最佳方法。最后将优化后的硅珠回收小片段DNA的方法与CTAB法分别对高温处理后的转基因大豆进行DNA提取。结果表明,这6种方法中硅珠法对小片段DNA回收的能力最强。2.不同温度及酸碱处理对转基因大豆检测的影响本实验分别探究了不同温度和酸碱处理,转基因大豆中NOS、CaMV35S、EPSPS、BT这4个常用筛查元件中不同片段大小的DNA检测情况,并与国家标准《NY/T 675-2003转基因植物及其产品检测大豆定性PCR方法》中的检测结果比较,实验结果表明,转基因大豆DNA对温度更加敏感,处理的温度越高,时间越长,DNA降解程度越大,并且,在转基因成分检测时,条带较小的目的片段更容易被检测到,而检测的目的条带较大时,极易造成假阴性的结果。3.基于数字PCR技术研究温度对转基因大豆DNA的降解规律实验进一步探究了温度处理后转基因大豆中基因降解规律。主要利用数字PCR技术探究了NOS、CaMV35S、EPSPS、BT基因的降解规律。结果表明,温度均能引起这4个筛查元件不同程度的降解,且处理的温度越高,降解程度越大。同时,在这4个元件中,CaMV35S基因对温度最为敏感,EPSPS基因对温度处理的敏感程度最低。4.不同PCR技术检测食品加工中转基因水稻TT51-1为了评估食品加工过程对转基因检测的影响,本实验利用PCR技术,定性和定量检测了食品加工品中转基因水稻TT51-1。在不同的处理阶段,利用标准或是已经验证过的引物和探针,通过传统的定性PCR、qPCR和dPCR技术检测米饼中TT51-1成分。对于传统的定性PCR技术,很难在烘烤、油炸和微波处理的样品中检测到相对较长的扩增目的片段,如Bt基因(301bp)和事件特异性基因(274bp)。而qPCR在水煮、干燥、烘烤和微波样品中均检测到扩增荧光信号,油炸样品中没有检测到荧光信号。而采用和qPCR引物相同的传统定性PCR检测所有样品中相应较短的目的片段,这些传统定性PCR结果与qPCR结果基本一致。结果表明,食品加工直接影响转基因成分的检测,建议选择相对较短的片段作为分析的扩增目标。在本实验中建立了qPCR和双重ddPCR体系去定量检测TT51-1。正交实验结果表明,TT51-1/PLD双重ddPCR的最佳条件为引物/探针500/250 nM,退火温度为58℃。两种方法都可以定量检测加工后样品中TT51-1的含量,而双重ddPCR由于其稳定性、准确性、PCR抑制剂的耐药性以及不需要参考材料等优点,成为检测加工食品中转基因成分更有吸引力的方法。综上所述,在常见的6种DNA回收方法中硅珠法提取和回收小片段DNA效果最好。在食品加工过程中,温度和pH值均能引起DNA降解,且温度影响更大,所以在检测时,应选用较短的目的片段,选用检测结果更稳定可靠的数字PCR。