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研究背景慢性非细菌性前列腺炎是前列腺炎四种分类中最常见的类型,其发病率高,占据所有慢性前列腺炎病例的90%以上,临床症状复杂多样。有些患者表现为下腹部及会阴部的疼痛症状,有些患者主要表现为尿频尿急等排尿症状,还有多数患者主诉勃起功能不良等性功能障碍症状,严重影响患者的生活质量。目前,慢性前列腺炎发病机制不明确,临床上缺乏有效的治疗药物,疾病治疗后易复发,给患者造成严重的经济和心理负担。以往的研究认为慢性前列腺炎的发病与神经肌肉作用、微生物因素、内分泌紊乱等多种致病因素相关。近年来,越来越多的研究发现慢性前列腺炎患者中存在炎性细胞因子表达改变以及免疫细胞比例失衡,并且免疫失调与疾病的发生,局部疼痛症状,精神症状以及痛觉过敏症状均密切相关。例如,有研究发现小鼠的Treg细胞(regulatory T cell,Treg cell)功能受到抑制时,其慢性前列腺炎的易感性增加。也有研究提出抑制Treg细胞的功能,增加Th1细胞(T helper cell 1,Th1 cell)及Th17细胞(T helper cell 17,Th17 cell)的数量可以加重前列腺炎小鼠的局部疼痛症状,说明活化Th1细胞和Th17细胞可以促进前列腺炎小鼠出现局部疼痛症状。同样有研究发现一些小分子物质如miRNA的等位基因突变可以降低慢性前列腺炎患者的勃起功能不良的发病风险。因此,免疫因素在慢性前列腺炎发病过程中发挥重要调控作用。目的为了进一步探讨慢性前列腺炎的免疫致病机制,研究免疫细胞或免疫相关信号通路在疾病中的调控作用。本实验拟分为两个部分,第一部分通过测序技术检测慢性非细菌性前列腺炎模型组织中差异表达的miRNA,并富集出与疾病相关的信号通路,并在第二部分实验中进一步探讨前期富集的关键通路在前列腺炎免疫模型疾病进展中的调节作用和相关机制。方法首先建立慢性非细菌性前列腺炎模型。然后使用进行二代深度测序检测前列腺组织中miRNA的表达改变,并通过基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)等生物信息学分析方法富集疾病相关的信号通路,进一步探索其在疾病中的调控作用。其次在第二部分研究中,为了进一步明确免疫因素在慢性前列腺炎中的致病作用及相关机制,我们构建了自身免疫性前列腺炎小鼠模型,利用流式细胞检测技术比较炎症组和正常组中CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞数量上的差异,并检测Treg细胞分化和功能的重要调控因子GATA-3和CTLA-4的表达水平。同时,流式分选出两组小鼠CD4~+CD25~-细胞和CD4~+CD25~+细胞,将CD4~+CD25~-细胞使用CFSE染色之后与自体CD4~+CD25~+细胞进行混合培养,检测两组Treg细胞功能上的变化,探索在慢性前列腺炎中Treg细胞是否存在数量和功能上的异常。之后,选择第一部分测序富集出的自噬信号通路作为研究靶点,通过流式分选技术分选出两组的CD4~+CD25~-细胞,观察激活自噬能否促进CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞的分化,同时检测GATA-3的表达变化。之后再次通过磁珠分选两组CD4~+CD25~-细胞和CD4~+CD25~+细胞,在两种细胞共培养实验中添加雷帕霉素,观察激活自噬对Treg细胞抑制功能的调控作用,并检测细胞中GATA-3和CTLA-4表达水平的变化。最后再通过对炎症小鼠进行腹腔注射雷帕霉素的实验方法,观察激活自噬是否能缓解前列腺炎局部疼痛症状,减轻局部炎症,并恢复炎症组小鼠Treg细胞的数量和抑制功能。结果在第一部分测序实验中,共检测出84个表达水平存在显著差异的miRNA。并且,测序所得慢性前列腺炎组织中大多数表达异常的miRNA如miR-146b-5p,miR-155-5p,miR-150-5p,miR-139-5p的表达模式的改变与已经报道的这些miRNA在其他炎性疾病中的表达模式的改变相似。进一步生物信息学分析也富集出多种信号通路如自噬信号通路,MAPK信号通路,cAMP信号通路,mTOR信号通路,文献检索发现这些通路均在免疫应答中发挥重要作用,提示免疫系统参与慢性非细菌性前列腺炎的发病和进展。在第二部分研究中,我们发现炎症组小鼠与对照组小鼠相比CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞的数量下降,抑制功能减弱,伴有细胞GATA-3和CTLA-4表达水平下降。同时,相比于对照组小鼠,炎症组小鼠的局部疼痛耐受程度也有所下降,疼痛敏感性增强。进一步实验发现使用自噬激活剂雷帕霉素可促进两组小鼠CD4~+CD25~-细胞向CD4~+CD25~+FOXP3~+Treg细胞分化,增加Treg细胞的数量,并上调Treg细胞内GATA-3的表达水平。体外功能抑制试验同样发现,使用自噬激活剂可以增强CD4~+CD25~+调节性T细胞的抑制功能,并上调CFSE阴性细胞群中FOXP3~+GATA-3~+细胞和FOXP3~+CTLA-4~+细胞的比例。之后,给予炎症鼠腹腔注射自噬激活剂雷帕霉素可增加炎症鼠疼痛阈值,降低炎症因子IL-1β在前列腺组织局部的表达,表明腹腔注射雷帕霉素可以减轻慢性前列腺炎局部疼痛症状,缓解局部炎症水平。进一步的流式细胞学实验显示,注射雷帕霉素可以增加炎症鼠Treg细胞的数量,增强Treg细胞的抑制功能,同时上调Treg细胞中GATA-3和CTLA-4的表达。结论本次研究证实miRNA在慢性前列腺炎的发病过程中发挥调控作用,并且通过生物信息学分析发现,多种免疫相关信号通路如自噬信号通路与慢性非细菌性前列腺炎的发病相关,证实免疫因素是慢性前列腺炎的致病因素之一。进一步的研究揭示了免疫细胞Treg细胞在慢性前列腺炎疾病进展中出现数量降低和功能抑制。提高自噬水平可以促进Treg细胞的分化,增加其数量,并增强其免疫抑制功能,缓解前列腺组织局部炎症和疼痛症状。我们的研究为进一步探索前列腺炎的免疫致病机制提供了一定的基础,为改善慢性前列腺炎的治疗效果提供了新的思路。