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生物活性肽是具有调节机体生命活动和某种生理活性功能的肽的总称。蛋白肽易吸收、生物活性强、安全性高、无毒副作用,具有特殊的氨基酸组成,已被证实其具有抗肿瘤、抗氧化、抗高血压、降胆固醇等功效。已有研究发现,绿豆肽具有免疫调节作用,但对于绿豆肽在先天免疫方面是如何发挥免疫调节作用的机制还不甚清楚。本研究以绿豆肽(Mw<1000 Da,含量96%)为原料,以机体先天免疫系统的巨噬细胞为模型,结合色谱技术、光谱技术,研究绿豆肽结构与其免疫活性的关系,找出具备较高免疫活性的绿豆肽分子量、氨基酸序列及关键组分;进而研究绿豆肽对RAW264.7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子以及相关信号通路基因的表达,找出绿豆肽具有免疫活性的关键因子;建立环磷酰胺致免疫低下小鼠模型,探讨绿豆肽对免疫低下小鼠天然免疫活性以及相关免疫信号通路,以揭示绿豆肽激活巨噬细胞,发挥非特异免疫的作用机制,从机理角度阐明绿豆肽的高免疫活性。1.利用细胞和分子生物学技术,从体外水平研究不同剂量的绿豆肽对RAW264.7巨噬细胞影响,以探讨绿豆肽的免疫调节活性。结果得出,绿豆肽呈剂量依赖性提高细胞增殖率、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活力、一氧化氮含量(Nitric oxide,NO)以及细胞因子分泌量,还可显著抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导细胞的肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-6分泌量。且绿豆肽能降低LPS诱导巨噬细胞胞内微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 Light chain 3,LC3)的含量,并促进LC3-I向LC3-II的转化,下调LC3II/LC3I蛋白的表达量,上调胞内p62蛋白的表达量。结果表明,绿豆肽具有较强的免疫活性,且免疫活性的发挥与绿豆肽促进免疫活性物质分泌、调节细胞因子分泌以及抑制细胞自噬等多种因素有关。2.采用SephadexG-15层析法分离得到三个不同级分的绿豆肽,采用色谱技术、氨基酸分析技术以及光谱技术,结合免疫活性测定得出:绿豆肽的第三级分(P3峰)的免疫活性最强,疏水性也较强,巨噬细胞糖原、核酸代谢活性显著增加,IL-1β、IL-6和IL-10的水平提升。采用液质联用装置对分离后得到的P3进行结构鉴定,得出P3的主要氨基酸序列分别为Phe-Leu-Val-Asn-Arg-Ile(885.1 Da),Phe-Leu-Val-Asn-Pro-Asp-Asp,(961.06Da),Lys-Asp-Asn-Val-Ile-Ser-Glu-Leu(1043.13 Da)。FTIR光谱分析结果得出绿豆肽在α-螺旋结构含量增加时免疫活性增强。3.采用PCR技术分析不同处理组的TLR1、TLR2和TLR4受体mRNA表达量水平,结果表明LPS组的TLR1、TLR2和TLR4 mRNA表达量显著提高(p<0.05),绿豆肽组对巨噬细胞TLR1和TLR4受体表达量有一定影响,但对TLR2受体无明显影响;绿豆肽能显著抑制LPS诱导巨噬细胞的TLR1、TLR2和TLR4 mRNA表达量。采用anti-TLR1和anti-TLR4抗体对RAW264.7细胞进行处理,测定绿豆肽对阻断TLR受体的处理组的细胞因子表达水平,结果表明anti-TLR1和anti-TLR4处理组的IL-6、IL-1β和TNF-α的细胞因子分泌水平显著低于MBPs组,且TLR1阻断组的细胞因子分泌水平显著被抑制,抑制水平达到50%以上,这些研究结果推断出TLR1是绿豆肽激活巨噬细胞的主要受体。4.采用western blotting方法对MAPK的三个主要亚基p38,ERK1/2和JNK以及其磷酸化表达水平和NF-κB通路的相关蛋白进行分析,结果为绿豆肽对巨噬细胞MAPK通路的三个主要亚基p38、ERK1/2和JNKLPS的表达量有显著影响。采用MAPK信号通路的P38抑制剂(SB203580)、ERK抑制剂(PD98059)、JNK抑制剂(SP600125)处理巨噬细胞,分别测定绿豆肽对巨噬细胞的TNF-α和IL-6分泌量,结果得出p38和ERK1/2抑制剂对巨噬细胞TNF-α和IL-6的分泌量影响较大,表明绿豆肽激活细胞因子的表达依赖于MAPK相关的信号通路,且p38和ERK对巨噬细胞的细胞因子分泌起主要作用。LPS处理组的细胞核内p65和细胞质中IκBα的相对蛋白表达水平显著升高,而采用不同浓度绿豆肽处理LPS诱导组的细胞核内p65和细胞质中IκBα相对蛋白表达水平呈浓度依赖性降低;绿豆肽可以激活NF-κB的核移位,但其入核程度显著低于LPS。采用NF-κB通路的特定抑制剂处理巨噬细胞得出,绿豆肽处理组的TNF-α和IL-6的分泌量较正常组小,这表明绿豆肽激活细胞因子的表达依赖于MAPK和NF-κB通路。5.采用ELISA、PCR和western blotting技术分析绿豆肽对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性以及相关信号转导通路进行研究,结果得出绿豆肽组小鼠腹腔巨噬细胞的TNF-α分泌量显著增加,而经TLR1阻断剂处理后的小鼠腹腔巨噬细胞的TNF-α分泌量较未处理组显著降低,且不同浓度绿豆肽对小鼠巨噬细胞的TNF-α分泌量影响无差异。不同浓度绿豆肽可显著增加小鼠腹腔巨噬细胞的IL-6分泌量;而TLR1阻断剂处理后各组的IL-6分泌量显著低于绿豆肽组。绿豆肽可以通过调节MAPK和NF-κB信号通路调节绿豆肽诱导TNF-α和IL-6等细胞因子的产生,证明绿豆肽是通过MAPK和NF-κB信号通路激活巨噬细胞。6.绿豆肽可改善环磷酰胺致免疫低下小鼠的脾脏状态,增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,提高TNF-α和IL-6等细胞因子的分泌,且绿豆肽可显著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬细胞的MAPK和NF-κB通路相关蛋白表达,证实绿豆肽是经由MAPK和NF-κB信号通路激活巨噬细胞,发挥先天免疫作用。在此基础上对免疫低下小鼠进行热应激处理,结果表明绿豆肽能很好的改善免疫低下小鼠血清的皮质醇和葡萄糖浓度,以及SOD和谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase,GOT)活性,这也说明绿豆肽可提高免疫低下小鼠的机体活力,即提高了免疫低下小鼠的免疫能力。综合以上结果,绿豆肽可通过激活巨噬细胞相关细胞因子的表达发挥免疫活性,且免疫活性与其分子量大小、氨基酸含量、疏水性以及二级结构性质有关;绿豆肽能够上调机体内巨噬细胞的TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,抑制LPS诱导的巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,这一过程可能是通过TLR1受体调控p38、ERK1/2和NF-κB信号通路实现的。