论文部分内容阅读
就眠蜕皮是家蚕幼虫的一种重要生理现象，家蚕眠性性状主要受第6连锁群上的眠性主基因M控制，此外还受到许多修饰基因及环境条件的影响。本研究应用高分辨率熔解分析（HRM）技术筛选具有多态性的SSR标记，进行眠性主基因的定位，进而应用RACE技术克隆候选基因，并对候选基因的表达进行检测，以期找出控制家蚕眠性的主基因。本研究取得的主要进展如下：（1） HRM技术用于家蚕SSR分子标记基因型鉴定可行性理论上HRM技术可以鉴定单个碱基的基因型多态性，为了优化和确定适合于家蚕基因组SSR分子标记的HRM分析的技术参数，并验证熔解曲线多态性产生的机制，我们选择实验中出现频率较高的3种典型熔解曲线多态性的多态性标记产物进行回收克隆测序，并进行CLUSTALW比对。结果表明，应用HRM分析技术筛选出的标记多态性的产生机制多数是序列长度多态性和单碱基多态性的综合作用。研究结果验证了HRM技术应用于家蚕SSR标记基因型分析的可行性和可靠性。（2）家蚕眠性主基因M的定位本研究采用四眠蚕品种大造（p50，+M/+M）与三眠蚕品种C3白（M3/M3）构建BC1M回交群体p50×（C3白×p50），选择其中的598头三眠蚕个体作为定位群体，应用高分辨率熔解曲线分析（HRM）技术进行家蚕基因组SSR标记基因型分析，对M基因进行精细定位。通过HRM筛选与M基因连锁的多态性SSR标记，绘制出遗传总距离为2.4cM的精细分子标记连锁图，标记S2853-2527和S2853-2843紧邻M基因两侧，遗传距离分别是0.2cM和0.7cM，M基因位于家蚕基因组nscaf2853:2,527,929～2,843,864之间，其间有4个预测基因，都属于序列特异的DNA结合转录因子，推测眠性主基因的作用方式可能与此有关。（3）候选基因3’RACE在M基因的精细定位的基础上，结合家蚕全基因组数据库，根据候选基因的预测CDS区序列设计特异性引物，利用RACE技术快速扩增获得定位区间4个候选基因的cDNA3’端序列。针对BGIBMGA006391-TA基因进行3’RACE，在p50品系中得到1个序列（p506391），在C3白品系中得到2个序列（C3白6391-1，C3白6391-2）。C3白6391-1是BGIBMGA006391-TA的正确产物，具有完整的3’端。C3白6391-2序列可能是BGIBMGA006392-TA的产物，具有完整的3’端。针对BGIBMGA006393-TA基因进行3’RACE，在p50品系中得到1个序列（p506393），具有完整的3’端，长度为1038bp。针对BGIBMGA006394-TA基因进行3’RACE，在p50品系中得到2个克隆产物（p506394-1，p506394-2），在C3白品系中得到1个克隆产物（C3白6394）。p506394-1是BGIBMGA006394-TA的正确产物。p506394-2基因序列经BC1M回交定位群体HRM分型验证确认该序列不属于第6连锁群。C3白6394不是BGIBMGA006394-TA，是距离BGIBMGA006394-TA基因约80K的位置上存在的另外1个共有保守序列的同源基因。（4）候选基因的表达分析本研究根据候选基因3’RACE的结果，采用荧光定量RT-PCR技术，对四眠品系p50和三眠品系C3白两个品系中5个不同基因在幼虫期不同发育时期的表达量进行了检测分析。从各个基因的表达谱的变化与就眠蜕皮、p50与C3白品系间眠性差异的关联性分析，p506391、C3白6391-1、C3白6391-2的表达量的变化动态与幼虫期的就眠蜕皮及眠性均未能发现有关联性，可以认为预测基因BGIBMGA0006391-TA与眠性性状无关。p506393基因的表达模式在三眠蚕的1龄与四眠蚕的1-2龄相似，三眠蚕的2-3龄与四眠蚕的3-4龄相似。四眠蚕品种3-4龄的高表达、三眠蚕品种2-3龄的高表达与终龄的决定似乎有一定的关联。C3白6394基因在p50及C3白品系各个龄期的表达模式的差异和转换与p506393基因十分相似，该基因的表达量的变化与就眠蜕皮周期及眠性性状可能也存在一定的关联。p506394基因仅在p50品系中检测出表达，在C3白品系的所有发育时期样品中均未能检测出表达。分析该基因与眠性主基因及眠性性状可能无关。本研究所获得的结果为揭示家蚕眠性这一复杂性状的调控模式研究提供了重要的基础信息。