本研究的主要目的是评价获能、冷冻、处理时间对精子蛋白酪氨酸磷酸化位点分布与表达以及质量的影响。本次试验主要使用了姬姆萨染色法染色、考马斯亮蓝染液染色、免疫荧光、SDS-PAGE和Western免疫印迹分析等方法分别检测了精子活力、顶体完整率、蛋白酪氨酸磷酸化位点分布与表达。试验主要分为：Ⅰ采用不同的冷冻方法、不同的解冻温度以及孵育的不同时间来检测精子的质量；Ⅱ检测猪精子置于mTBM溶液中获能处理时间(0、0.5、1、1.5及2h)对猪精子获能效率的影响;Ⅲ将获能处理不同时间的精子进行间接免疫荧光处理,荧光显微镜下显示精子蛋白酪氨酸磷酸化位点的变化；Ⅳ将获能处理不同时间的精子进行SDS-PAGE和Western免疫印迹分析。试验结果如下：1、快速冷冻法和慢速冷冻法之间的冷冻效果差异不显著(P>0.05),使用0.5 ml细管冷冻时,慢速冷冻和快速冷冻法之间的冷冻效果差异显著(P<0.05)。慢速冷冻法时,使用0.25 ml和0.5 ml细管冷冻,解冻后精子活力、顶体完整率差异不显著(P>0.05)；快速冷冻时,使用0.25ml和0.5 ml细管冷冻,解冻后精子活力、顶体完整率差异显著(P<0.05),0.25 ml细管优于0.5 ml细管；在40℃和45℃水浴中解冻,解冻后精子活力、顶体完整率差异不显著(P>0.05),但均优于35℃水浴中解冻,并且差异显著(P<0.05)。使用0.25ml细管冷冻时,解冻温度40℃优于45℃,二者之间差异显著(P<0.05)。解冻温度相同时,使用0.25 ml和0.5 ml细管冷冻时,解冻后精子活力差异显著(P<0.05),0.25 ml细管优于0.5 ml细管；解冻后孵育20 min、30 min和40 min精子活力、顶体完整率差异显著(P<0.05),30 min最好,孵育40 min后精子活力、顶体完整率显著下降(P<0.05)。2、获能时间增加,精子活率降低,获能时间为2h组与其他组之间差异显著(P<0.05)。获能时间对精子质膜完整性的影响较大,随着获能的进行,精子质膜完整率降低。3、获能处理对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化水平变化影响明显；未经处理的精子仅在精子颈部可见略淡的酪氨酸磷酸化位点。而经过处理的精子蛋白酪氨酸磷酸化程度加深,荧光显色明显,在精子顶体部和尾部均可见明显的酪氨酸磷酸化位点。随着获能处理时间的延长,精子顶体部与尾部荧光显色越来越明显,证明获能处理能够引起精子内部酪氨酸磷酸化蛋白发生磷酸化。获能处理1h和1.5h时,精子蛋白酪氨酸磷酸化位点集中在顶体部和尾部。4、随着获能时间的增加,精子出现了一些新的磷酸化蛋白位点,而在2h时有部分蛋白位点丢失；猪精子体外获能孵育0至0.5 h, Western blot仅检测到一种分子量为27 ku的酪氨酸磷酸化蛋白,且这种蛋白的酪氨酸磷酸化水平随着获能的进行呈递增趋势。体外孵育1h,检测到另一种47 ku的酪氨酸磷酸化蛋白,此蛋白酪氨酸磷酸化水平在体外获能孵育1.5 h达到最高峰,后随获能的进行呈递减趋势。