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研究背景核因子κB活化因子受体配体(Receptor or Activator of NF-KB Ligand,RANKL)/核因子κB活化因子受体(Receptor or Activator of NF-KB,RANK)/护骨素(Osteoprotegerin,OPG)系统是一个已经被证实与骨代谢和骨损伤密切相关的系统,而且作为肿瘤坏死基因家族的成员,该系统又与免疫系统之间有着密切的联系,由此产生的新的学科分支--骨免疫学是近年来热门的研究话题。研究显示,该系统的基因单核苷酸多态性(Single-nuclear polymorphism,SNP)与骨质疏松症(Osteoporosis,OP)、某些自身免疫病的易感性及其骨代谢和骨损伤相关。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性滑膜炎为主要病理特点、以骨与关节损伤为主要危害的慢性、炎症性、全身性自身免疫性疾病,其骨与关节的损伤主要表现为局部的骨侵蚀/破坏和全身的骨丢失(以OP为主要表现),随着病变的反复发作、持续发展,最终可导致骨与关节的畸形、功能障碍和致残等,阻止骨与关节损伤的发生和发展是RA临床治疗的关键,因此探索RA患者骨与关节损伤发生的机制、探讨新的抑制其骨与关节损伤发生的治疗途径是研究的难点和重点。目的检测OPG基因(TNFRSF11B)1181G>C(rs2073618)位点、163A>G(rs3102735)位点和RANKL基因(TNFRSF11)401A>G(rs2277438)位点SNP、同时测定其各基因型患者上述基因表达产物——外周血清中OPG和可溶性RANKL(soluble RANKL,s RANKL)水平的变化,分析OPG和RANKL基因的SNP及其蛋白表达水平对RA患者疾病易感性、疾病活动性、骨与关节损伤——局部骨侵蚀(以双手Sharp评分表示)和全身骨丢失(以骨密度-Bone mineral density,BMD表示)变化的影响,探讨RANKL/RANK/OPG系统在RA中的意义。方法选择200例RA患者和201例相匹配的健康对照组,采用连接酶检测反应(LDR)-PCR方法检测OPG基因rs2073618、rs3102735位点和RANKL基因rs2277438位点SNP;同时采用ELISA法测定RA患者外周血中OPG和s RANKL的水平;采用DEXA法测定其中113例RA患者和120例正常对照组股骨和腰椎部位BMD;同时详细记录RA患者疾病活动性指标,包括关节肿胀数、关节肿胀指数、关节压痛数、关节压痛指数、VAS评分、晨僵时间、日常生活能力(HAQ)、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-CCP),计算疾病活动性积分(disease activity score 28,DAS28);摄双手X线平片,根据Sharp评分标准进行双手X线Sharp评分。比较其等位基因分布频率、基因型频率及单倍体型在RA组及对照组中的分布,分析上述基因SNP对RA患者外周血中OPG和s RANKL水平的影响,并比较不同基因型RA患者中外周血OPG和s RANKL水平、各部位BMD、Sharp评分及各项疾病活动性指标间的差别。结果1.OPG基因rs2073618位点、rs3102735位点和RANKL基因rs2277438位点各等位基因及基因型分布频率在RA组与对照组中均无明显差别(P>0.05)。2.OPG和RANKL基因单倍体型(rs2073618G-rs2277438G-rs3102735G)携带者RA疾病易感性明显降低(1.5%vs 6.0%)(OR:0.216,95%CI:0.081-0.575,P=0.0008),OPG和RANKL基因单倍体型(rs2073618G-rs2277438A-rs3102735G)携带者RA易感性明显增加(14.5%vs 8.4%)(OR:1.862,95%CI:1.179-2.943,P=0.007)。3.RA患者外周血s RANKL水平[79.69(43.59)vs 70.13(30.61),z=2.368,P=0.018]、和s RANKL/OPG比值[0.41(0.20)vs 0.27(0.26),z=5.259,P<0.0001]均较正常组明显升高,RA患者外周血OPG水平[202.86(123.44)vs 285.14(318.61),z=4.029,P<0.0001]较正常组明显降低。4.RA患者中OP的发生率为31.9%(36/113),明显高于对照组13.3%(16/120)(x2=11.520,P=0.001)。RA组中伴OP的患者的年龄(59.03±12.67 vs 51.75±11.62,t=3.021,P=0.003)、关节肿胀数[10.5(7)vs 7(6),z=2.138,P=0.032]、双手X线关节间隙狭窄评分[54.5(65)vs 11.5(30),z=3.210,P=0.001]、双手X线骨侵蚀评分[47(82)vs 10(31),z=3.263,P=0.001]和双手X线Sharp评分[103(146.5)vs 22(62.75),z=3.355,P=0.001]明显高于无OP的RA组,而其他临床及实验室指标(包括外周血s RANKL和OPG水平)在两组间无明显差别(P>0.05)。5.RANKL基因rs2277438位点表达为纯合型(AA或GG型)的RA患者(n=62)在L3(1.05±0.22 vs 0.93±0.26,t=2.314,P=0.023)、L4(1.06±0.24 vs 0.94±0.28,t=2.207,P=0.030)、L2-4(1.04±0.21 vs 0.89±0.28,t=2.788,P=0.007)部位BMD均明显高于杂合型(AG型)RA患者(n=39),双手X线Sharp评分[15.50(46.75)vs 43.00(108.75),z=2.419,P=0.016]和外周血s RANKL水平[66.18(29.05)vs 84.51(73.09),z=2.491,P=0.013]则明显低于表达为杂合型(AG型)的RA患者;OPG基因rs2073618和rs3102735位点不同基因型RA患者间BMD、双手X线Sharp评分和外周血OPG水平比较,差别无统计学意义(P>0.05)。6.OPG基因rs2073618位点表达为纯合型(CC或GG型)的RA患者(60例)在下列疾病活动性指标上明显高于表达为杂合型(CG型)的RA患者(40例):关节压痛数(12.69±6.36 vs 9.04±5.22,t=2.352,P=0.022)、关节压痛指数(17.19±8.09 vs11.88±6.32,t=2.732,P=0.008)、晨僵时间[30(180)vs 5(30),z=2.161,P=0.031]、VAS评分[6(2)vs 4(2),z=2.962,P=0.003]和DAS28(6.20±0.97 vs 5.30±1.61,t=2.388,P=0.023)。RANKL基因rs2277438位点、OPG基因rs3102735位点不同基因型RA患者间各疾病活动性指标无差别(P>0.05)。7.相关性分析显示:RA患者外周血s RANKL水平与OPG水平呈正直线相关(r=0.568,P<0.0001);RA患者各部位BMD均与年龄呈显著负直线相关(P<0.0001),RA患者各部位BMD(总的腰椎2-4部位BMD除外)均与双手X线Sharp评分呈负直线相关(P<0.05-0.0001);腰椎2-4部位BMD与外周血s RANKL/OPG比值呈负直线相关(r=-0.285,P=0.003);股骨Neck区、Ward区、G.T.区和总股骨区BMD与RA病程和关节肿胀数呈负直线相关(P<0.05-0.001),L2、L3和L4部位BMD与CRP呈负直线相关(P<0.05-0.001)。RA患者外周血s RANKL水平、OPG水平和外周血s RANKL/OPG比值与RA患者各疾病活动性指标间均无相关性(P>0.05)。8.采用多元Linear Regression分析,以年龄、病程、外周血s RANKL/OPG比值、RF、DAS28、抗CCP抗体为自变量,以Sharp评分为应变量,结果显示:RA患者Sharp评分与病程(β=0.725,t=9.078,P<0.0001)、外周血s RANKL/OPG比值(β=0.166,t=2.104,P=0.039)、年龄(β=-0.179,t=2.274,P=0.026)呈直线相关(R2=0.570,F=33.137,P<0.0001)。以DAS28为应变量,多元线性回归未发现外周血s RANKL、OPG水平及外周血s RANKL/OPG比值与RA患者的疾病活动性有关。9.以年龄、性别、BMI、病程、是否使用糖皮质激素、DAS28、Sharp评分为自变量,以总的股骨或腰椎是否发生OP(0=无OP,1=OP)为应变量,采用二项分类的多元回归分析Logistic Regression(Backward LR法)分析上述自变量的变化对RA患者OP发生的影响,结果发现:年龄(OR=1.058,P=0.014,95%CI:1.012-1.106)和Sharp评分(OR=1.021,P=0.001,95%CI:1.008-1.033)为RA患者发生OP的危险因素(R2=0.262,x2=17.692,P=0.001)。增加OPG基因rs2073618位点基因型(1=CC或GG,2=CG)、OPG基因rs3102735位点基因型(1=AA或GG,2=AG)和RANKL基因rs2277438位点基因型(1=AA或GG型,2=AG型)为自变量后,再次采用二项分类的Logistic Regression(Backward LR法)分析,结果发现:RANKL基因rs2277438位点基因型(1=AA或GG型,2=AG型)为RA患者发生OP的独立危险因素(OR=2.932,P=0.048,95%CI:1.008-8.529)。结论1.OPG基因rs2073618、rs3102735位点和RANKL基因rs2277438位点SNP与安徽籍汉族RA患者的易感性无关;但OPG和RANKL基因单倍体型(rs2073618Grs2277438G-rs3102735G)为RA的保护性因素,而单倍体型(rs2073618Grs2277438A-rs3102735G)是危险因素。2.RANKL/OPG基因SNP对RA的影响各司其职;RANKL基因rs2277438位点SNP与RA患者的外周血s RANKL水平升高有关,并与RA患者局部骨侵蚀和椎体OP的发生相关。OPG基因rs2073618位点SNP与RA患者疾病活动性相关。3.作为RA骨与关节损伤的两大表现形式:全身骨丢失与局部骨侵蚀是密切相关的,RANKL/OPG系统是联系它们的纽带。