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第一章小鼠骨折愈合中骨痂组织mmu-miR-142-5p表达模式的研究目的建立小鼠骨折愈合模型,研究mmu-miR-142-5p在小鼠骨折愈合过程的表达模式。方法予C57BL/610-11周龄、雄性小鼠行单侧开放性股骨干横形骨切开并锁钉内固定术,建立小鼠骨折愈合模型；设立模型构建后第7d、14d、21d、28d四个观测点,放射学X线分析骨折部位；制作骨痂组织石蜡切片,HE染色,分析骨折部位组织学变化；分离未经造模的小鼠股骨干处骨组织(基线对照)及骨痂组织,Trizol提取组织总RNA,实时定量RT-PCR检测mmu-miR-142-5p及成骨细胞分化标志物骨钙素mRNA在对照骨组织及骨痂组织中的表达水平。结果1.小鼠单侧开放性股骨干横形骨切开术并锁钉内固定模型构建成功,适用于小鼠骨折愈合的研究。2.该模型小鼠新骨形成主要经由软骨内成骨的方式；骨折愈合历时28天基本完成,在建模后21天,骨性骨痂基本形成,成骨作用达高峰。3.小鼠骨折愈合中骨痂组织的骨钙素mRNA表达水平逐渐升高,至21天达到峰值(基线值4.15倍),后略有降低；其指向的成骨细胞功能状态与放射学及组织学分析相符。4.小鼠骨折愈合中骨痂组织的mmu-miR-142-5p表达水平逐渐升高,至21天达到峰值(基线值12.58倍),后略有降低；与骨钙素mRNA的表达模式趋同。结论小鼠骨折愈合中骨痂组织mmu-miR-142-5p表达激活,或与成骨细胞活性相关。第二章mmu-miR-142-5p对成骨细胞功能的影响及机制研究目的研究mmu-miR-142-5p对成骨细胞矿化的影响,预测mmu-miR-142-5p的作用靶基因,初步探讨mmu-miR-142-5p在成骨细胞矿化过程中的作用机制。方法用p-甘油磷酸钠和抗坏血酸诱导小鼠前成骨细胞MC3T3-E1矿化,在矿化诱导第5、11、17天分别采用agomiR-142-5p、agomiR-NC以及antagomiR-142-5p、antagomiR-NC直接、连续转染,同时设立空白对照(Mock),以构建mmu-miR-142-5p功能获得性及功能缺失性的MC3T3-E1细胞模型；首次转染48小时后提取各组细胞总RNA,实时定量RT-PCR测定mmu-miR-142-5p及成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、骨钙素(Osteocalcin, OC) mRNA的表达水平；酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测48小时后MC3T3-E1细胞分泌至培养液上清中ALP及OC的蛋白水平；矿化诱导21天即末次转染后第4天,茜素红染色及定量观察各组基质矿化情况；用TargetScan等靶基因预测软件分析mmu-miR-142-5p在成骨矿化过程中的作用靶基因,在上述细胞模型首次转染48小时后提取各组细胞总RNA及总蛋白,实时定量RT-PCR及Western杂交检测靶基因mRNA和蛋白水平。结果1.外源性核酸agomiR-142-5或antagomiR-142-5p转染可上调或下调MC3T3-E1细胞中mmu-miR-142-5p的丰度及活性。2.与对照组相比,agomiR-142-5p转染能上调MC3T3-E1细胞ALP和OC mRNA及分泌的蛋白表达水平,促进矿化结节形成,提高矿化结节茜素红定量；而antagomiR-142-5p转染导致MC3T3-E1细胞ALP和OC mRNA及分泌的蛋白表达水平下降,矿化结节形成受阻,降低矿化结节茜素红定量。3.预测WWP1为成骨细胞矿化过程中mmu-miR-142-5p的作用靶基因。4.与对照组相比,agomiR-142-5p转染导致MC3T3-E1细胞WWP1蛋白水平下降,antagomiR-142-5p转染可上调MC3T3-E1细胞WWP1蛋白水平,但二者对MC3T3-E1细胞WWP1mRNA表达水平均无影响。结论mmu-miR-142-5p通过在转录后水平下调WWP1基因表达支持成骨细胞功能及矿化。