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Sf9细胞是从草地贪夜蛾蛹的卵巢组织中分离到的一个细胞系。对于多种核型杆状病毒,它是受纳细胞,在分子生物学中也得到广泛的应用。目前应用最广泛的真核基因表达系统是以AdMNPV-Sf细胞系为基础构建的杆状病毒表达系统。Sf9细胞系的主要作用是分离和重组杆状病毒繁殖种群和生产重组蛋白,也是昆虫大规模培养的对象。乙酰胆碱酯酶在生物神经传导中是一种关键性酶,其经典功能是水解兴奋性神经递质乙酰胆碱,从而保持神经突触传导的正常进行;此外,该酶还有一个功能就是参与细胞凋亡的进程。在动物细胞凋亡的过程中,AChE的表达会有所变化。另外由于次生物质是植物的重要防卫武器,对动物及其细胞会产生各种影响,其中之一就是诱导细胞凋亡。鉴于AChE的重要功能及其在害虫防治中常常被选作杀虫剂靶标的事实,本研究选择Sf9为研究材料,通过分子生物学和细胞生物学研究,了解昆虫细胞中AChE的表达与细胞凋亡的关系。开展的工作如下:1、通过花椒毒素、麦黄酮、喜树碱等不同次生代谢物质诱导昆虫细胞,显微镜下初步观察,流式细胞仪检测和Caspase 3酶活性检测,然后将产生凋亡的细胞,通过荧光定量检测对照组和实验组中AChE的表达量,通过Western blotting检测蛋白的含量变化。显微镜下观察到相比于对照组,1μmol/L喜树碱在12、24和36 h能够诱导细胞凋亡,麦黄酮和花椒毒素诱导不能诱导细胞凋亡;流式细胞仪检测结果显示1 μmol/L喜树碱在不同12、24和36 h的凋亡率要高于对照组.;Caspase 3酶活性检测表明1 μmol/L喜树碱在诱导Sf9细胞24 h的酶活最大;荧光定量检测显示经过1μmol/L喜树碱12、24和36 h诱导细胞,AChE的表达量分别增加3.7倍、6.2倍、2.5倍;Western blotting杂交检测结果表明经过喜树碱诱导凋亡的细胞蛋白量分别增加了 15.83%、15.27%、8.64%。2、根据登陆GenBank数据库中的序列,克隆了细胞凋亡因子AChE基因的部分开放阅读框(ORF)将测序正确的片段连接到pGEM-T easy载体上,通过限制性内切酶单酶切,再转录成单链RNA,混合成双链RNA,将双链RNA通过lipofectamineTM2000转染昆虫细胞,荧光定量PCR检测沉默效果。Western blotting杂交检测蛋白含量变化。荧光定量PCR检测结果表明经过0.3μg和1μg dsRNA沉默的细胞,AChE的表达量分别减少了 2.9倍和1.7倍;Western blotting杂交检测显示AChE蛋白的表达量分别减少了 7.08%和3.32%。本研究通过从细胞凋亡方面和通过双链RNA干扰沉默基因表达方面来研究AChE的作用,通过流式细胞仪和Caspase 3检测不同时间喜树碱诱导昆虫细胞,证明喜树碱能诱导细胞凋亡,然后通过荧光定量PCR和Western blotting杂交技术,检测凋亡细胞中的AChE,结果显示AChE表达水平升高。AChE-dsRNA对AChE具有沉默效果。这些研究结果为揭示AChE调控昆虫细胞凋亡,以及AChE参与昆虫与植物协同进化的分子机制奠定了一定的理论基础。