雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）是卫矛科雷公藤属木质藤本植物,具有资源丰富、杀虫活性高、广谱、对哺乳动物安全等优点。雷公藤次碱是其主要杀虫活性成分,具备开发为高效安全新型生物农药的潜力。然而,雷公藤次碱的杀虫分子靶标及作用机制至今尚不清楚。根据前期研究结果,推测雷公藤次碱作用于粘虫的肌肉系统,对钙离子通道及钙信号通路相关基因的表达有显著影响。基于以上,本研究以粘虫为研究对象,分别克隆了粘虫1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP₃R）和质膜钙泵（PMCA）基因,并分析了两种基因在粘虫中的时空表达,同时利用RNAi技术验证了两种钙通道蛋白在雷公藤次碱杀虫作用中的功能,为进一步阐明雷公藤次碱的杀虫作用机制奠定基础。主要研究结果如下:1、利用反转录多聚酶链式反应技术（RT-PCR）分别克隆了粘虫IP₃R和PMCA基因序列,分别命名为Ms IP₃R和Ms PMCA。Ms IP₃R开放阅读框长8118 bp,编码2076个氨基酸,预测其蛋白分子量和等电点分别为304784.46和6.04,编码蛋白具6个疏水跨膜区域。Ms PMCA开放阅读框长3438 bp,编码1146个氨基酸,预测其蛋白分子量和等电点分别为125957.46和6.59,编码蛋白具10个疏水跨膜区域。2、通过荧光定量PCR技术检测了IP₃R和PMCA基因在粘虫不同发育阶段及组织中的表达情况。Ms IP₃R与Ms PMCA在粘虫各个生长发育阶段及5龄幼虫的各组织中均有表达,其中,Ms IP₃R在粘虫成虫阶段相对表达量最高,是蛹期的21.28倍,在不同组织中,体壁肌肉中相对表达量分别是头部和消化道的6.19和4.23倍;Ms PMCA的表达分布与Ms IP₃R类似,Ms PMCA成虫阶段相对表达量是卵期的17.62倍,而体壁肌肉分别为头部和消化道的1.71和1.54倍。3、粘虫IP₃R可能不是雷公藤次碱的杀虫靶标。利用RNAi技术验证了粘虫IP₃R在雷公藤次碱杀虫作用中的功能。注射IP₃R基因ds RNA（ds IP₃R1和ds IP₃R2）片段72 h后对IP₃R的干扰率分别为39%和51%;注射ds IP₃R后对试虫幼虫的体重变化无明显影响;注射ds IP₃R 48 h后,再以LC₅₀剂量的雷公藤次碱饲喂48 h后,试虫死亡率分别为52.41%和57.58%,与同剂量下雷公藤次碱单独处理的试虫组无显著差异,说明ds IP₃R干扰后的试虫对雷公藤次碱的敏感性无显著变化,IP₃R可能不是雷公藤次碱的作用靶标。4、PMCA可能为雷公藤次碱的作用靶标之一。注射PMCA基因ds RNA（ds PMCA1和ds PMCA2）片段48 h后的干扰率分别为43%和49%;ds PMCA注射后试虫体重增长无明显变化,但注射ds PMCA 48 h后,饲喂带毒叶片(LC₅₀雷公藤次碱浸叶处理),48 h的死亡率分别为24.68%和17.82%,与仅用LC₅₀雷公藤次碱处理的试虫组相比,显著下降,说明ds PMCA处理后的试虫对雷公藤次碱的敏感性降低,推测PMCA可能为雷公藤次碱的作用靶标之一。综上所述,初步排除粘虫1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP₃R）作为雷公藤次碱作用靶标的可能性,而质膜钙泵（PMCA）在雷公藤次碱杀虫作用中具有重要地位。推测雷公藤次碱对其影响及效应为:对昆虫施用雷公藤次碱后,次碱进入昆虫体内与肌细胞的质膜钙泵相结合,引起Ca²⁺外流,导致胞内外Ca²⁺浓度失衡,进一步引起肌细胞受损及功能异常,最终引起昆虫的死亡。