水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)可以危害水稻、玉米、小麦等禾本科作物,引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病,对农业生产造成严重影响。前期通过蛋白质组学研究发现,RBSDV侵染后可诱导水稻核糖核酸酶蛋白的表达,该蛋白与核糖核酸酶家族的Os RNS4同源性最高,但在C端有5个氨基酸差异,在此将RBSDV诱导的核糖核酸酶仍按Os RNS4命名。为了分析Os RNS4在水稻黑条矮缩病毒侵染过程中的功能,本研究分析了RBSDV侵染对水稻不同组织中Os RNS4表达的影响,明确了Os RNS4和RBSDV P5-2之间的互作关系,构建了Os RNS4过量表达和干扰转基因植株,研究了Os RNS4在病毒侵染过程中的作用。取得的研究结果如下:1.明确了RBSDV侵染可诱导水稻不同组织中Os RNS4的表达。采用人工接种RBSDV方法接种3叶期水稻(日本晴和Kitaake),提取总RNA,反转录后进行半定量PCR和荧光定量PCR。半定量结果显示,RBSDV侵染后水稻根茎叶中Os RNS4的表达量均增加。采用荧光定量PCR方法分析表明,日本晴和Kitaake在没有病毒侵染的情况下,Os RNS4在叶中表达量最高,茎秆其次,在根系中表达量最低。RBSDV侵染后,Os RNS4在根、茎秆和叶中的表达量均显著增加,在茎秆中的诱导倍数最高。为分析Os RNS4的诱导量是否和病毒的积累量呈正相关,同时分析了水稻不同组织中RBSDV的积累量,结果显示病毒的积累量在茎秆中高于叶片,但在根中最高,表明Os RNS4的诱导表达量与病毒积累量没有直接相关性。2.病毒抗性鉴定结果表明,水稻9311的抗性显著高于日本晴,9311的发病率为10%,而日本晴的发病率为78%。为分析Os RNS4是否与水稻对病毒的抗性相关,9311和日本晴分别接种RBSDV,采用荧光定量PCR分析不同品种中Os RNS4的表达量变化,结果表明接种RBSDV后,9311中Os RNS4的表达量为未接种对照的28.89倍,日本晴中Os RNS4的表达量为未接种对照的1.65倍,表明Os RNS4可能参与水稻对RBSDV的防御过程。3.构建了过量表达和干扰Os RNS4的转基因水稻。采用PCR方法鉴定了植株,采用荧光定量PCR方法分析了转基因植株中Os RNS4的表达量。结果表明,过量表达转基因株系OE-T2-3、OE-T1-12、OE-T1-50和OE-T2-95中Os RNS4基因的表达量分别是对照的3.29倍、2.47倍、3.15倍和7.90倍;干扰株系中Os RNS4的表达量显著降低,RNAi-T1-4、RNAi-T2-46和RNAi-T2-140株系中Os RNS4基因的相对表达量分别是对照的0.48倍、0.01倍和0.08倍。4.为明确Os RNS4的作用,采用人工接种RBSDV的方法接种Os RNS4过量表达和干扰转基因植株。结果显示,过量表达Os RNS4后感染RBSDV的发病率降低,而干扰Os RNS4后,发病率增加;采用RT-PCR和荧光定量PCR方法分析了转基因植株中病毒的积累量,结果表明过量表达Os RNS4株系中RBSDV P5-2和P10基因的表达量低于对照,表明病毒积累量较低。以上结果表明Os RNS4在防御RBSDV侵染过程中起作用。5.分析了Os RNS4与RBSDV P5-2的互作关系。有研究表明Os RNS4可与RBSDV P5-2互作。由于本研究所获得的Os RNS4序列与已登录的Os RNS4在C端有5个氨基酸的差异,为此,分析了RBSDV侵染后诱导的Os RNS4和RBSDV P5-2的互作。酵母双杂交方法和荧光双分子互补实验均表明Os RNS4能直接与RBSDV P5-2互作。6.有研究报道外源施加ABA可增强植物对病毒的抗性,Os RNS4能增强水稻对ABA的敏感性。前期研究表明,RBSDV侵染可改变ABA合成和代谢关键基因的表达。为分析Os RNS4是否通过影响ABA途径进而影响病毒的侵染,我们采用酵母双杂交方法分析了Os RNS4与ABA合成途径关键酶Os NCED1、Os NCED2和Os NCED4的互作关系,发现Os RNS4能直接与Os NCED1和Os NCED4互作,推测Os RNS4通过与Os NCEDs互作影响ABA途径,进而影响病毒侵染。7.构建了P5-2转基因植株,过量表达RBSDV P5-2后,Os RNS4的表达量显著低于对照,表明RBSDV P5-2能负调控Os RNS4的表达。此外,分析了RBSDV P5-2转基因水稻中ABA合成关键基因的表达量变化。结果显示,Os NCED2、Os NCED3和Os NCED5的表达量均显著下降,Os NCED1和Os NCED4在不同转基因株系中结果不一致,还需进一步分析。以上结果表明,过量表达Os RNS4增强对病毒的抗性,推测Os RNS4可能通过与Os NCEDs互作,增强ABA合成途径,进而增强水稻对病毒的抗性,而病毒则可能通过P5-2与Os RNS4互作,抑制Os RNS4的表达,进而有利于病毒侵染。