论文部分内容阅读
背景:卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)是卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心Castleman病(multicentric Castleman’s disease,MCD)的病原体。人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)与KSHV之间的相互作用促进了艾滋病相关的KS(AIDS-related KS,AIDSKS)的发生。本课题组先前的研究证实,HIV-1编码的分泌型蛋白病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)通过上调靶向κB抑制因子α(inhibitor ofκBα,IκBα)的宿主细胞微小RNA(micro RNAs,mi RNA)mi R-942-5p激活核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)通路促进KSHV的潜伏感染(J Virol 2016;90(19):8739-53)。进一步的研究发现,Notch信号通路也介导了Vpr蛋白调控KSHV生命周期及部分宿主细胞因子的释放,然而其中的分子机制尚不清楚。目的:研究Vpr蛋白通过调控Notch信号通路影响KSHV生命周期及宿主细胞因子释放过程中所涉及到的mi RNAs及其作用机制;探究在此过程中Notch信号通路如何调控NF-κB信号通路的活化?方法:应用mi RNA芯片技术筛选出在Vpr蛋白作用下PEL细胞中表达具有显著性差异的mi RNAs;通过生物信息学分析、虫荧光素酶报告实验以及免疫印迹法(Western blot)等从表达上调的mi RNAs中筛选出具有抑制Notch1蛋白表达潜能的mi R-711;进一步通过点突变实验鉴定mi R-711与Notch1 3’非翻译区(untranslated region,UTR)的结合位点。运用功能丧失和功能获得实验从病毒裂解期基因转录、裂解期蛋白表达以及子代病毒颗粒释放等方面证实mi R-711在Vpr蛋白调控KSHV生命周期与影响细胞因子释放中的作用。最后应用Western blot、虫荧光素酶报告实验和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-q PCR)鉴定mi R-711靶向的Notch信号及其下游NF-κB通路在Vpr蛋白调控KSHV生命周期与宿主细胞因子释放过程中的作用与机制。结果:在mi RNA芯片筛选中发现了PEL细胞中一系列受Vpr蛋白调控且表达具有显著性差异的细胞mi RNAs。其中,Vpr蛋白作用下显著上调的mi R-711可以与Notch通路关键蛋白Notch1 3’UTR区直接结合抑制Notch1的表达。抑制mi R-711不仅能逆转被Vpr蛋白抑制的Notch信号通路活性,而且可以显著增强KSHV裂解性周期复制,并有效恢复宿主细胞因子的表达水平。相反,过表达mi R-711进一步增强了Vpr对KSHV裂解性周期复制的抑制以及增强了Vpr上调的细胞因子的表达。机制方面的研究证实,mi R-711靶向的Notch1入核后可作用于IκBα基因启动子区,通过调控IκBα基因的表达最终活化了NF-κB信号通路。结论:HIV-1 Vpr蛋白通过上调mi R-711来靶向抑制Notch信号通路,进一步抑制IκBα基因的表达,最终激活NF-κB通路,从而促进了KSHV的潜伏感染和细胞因子的释放。