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柳枝稷是纤维素乙醇转化的模式植物,通过遗传调控降低其木质素含量对培育能源用新品种具有重要意义。咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)是木质素生物合成途径中被普遍研究的关键酶之一。柳枝稷中抑制COMT因表达可降低木质素含量,提高生物乙醇产量。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)介导的反应是生命体必需的代谢过程,它可同时为初级代谢及COMT催化的反应提供甲基,进而影响植株存活及木质素生物合成。本试验拟研究柳枝稷中MTHFR基因的生理功能、MTHFR和COMT基因间功能协同性以及双基因共干扰对木质素代谢的调控效果。取得以下结果:(1)从柳枝稷中克隆出MTHFR的2个同源等位基因,包含完整的CDS,核苷酸大小1785bp,编码594个氨基酸。该基因的氨基酸序列存在保守的FAD、亚甲基四氢叶酸结合位点、SAM调节位点和植物特有的ATP合成酶位点,预测其蛋白功能保守。MTHFR基因在柳枝稷中为组成型表达,在不同组织表达量由高到低依次为茎节>节点>根>花序>叶鞘>叶片;在不同发育时期的茎部和叶片中,都在嫩茎和嫩叶中表达量较高。亚细胞定位显示柳枝稷MTHFR蛋白定位于细胞质。(2)利用RNA干扰方法获得MTHFR单基因干扰植株;以COMT-RNAi植株为材料,利用再转化方法获得MTHFR/COMT双基因干扰植株。①MTHFR基因在单基因干扰植株中干扰效率最高为56%,而在双基因干扰植株中可达92%,在组织培养过程中无法获得MTHFR单基因重度干扰的再生苗。根据基因干扰程度可将双基因干扰株系分成三类:COMT被重度干扰,MTHFR不变;双基因中度干扰;双基因重度干扰。②MTHFR单基因中度干扰不影响植株营养生长,但导致开花延迟;双基因中度干扰的植株生长发育正常,而双基因重度干扰会严重影响植株生长发育。③MTHFR单基因中度干扰未影响木质素生物合成;双基因重度干扰与COMT单基因干扰相比,木质素含量一致(降低8%-9%),但G-木质素合成显著降低(9%-13%),表明MTHFR基因重度干扰影响了G-木质素生物合成。④双基因共干扰引起植株叶片中出现类病变细胞死亡表型,表明MTHFR和COMT和因间存在功能协同性。机理分析表明,该表型的发生与参与氧化还原、防御、信号转导及激素代谢的基因被诱导有关,同时伴随着氨基酸和胁迫相关的酚酸类代谢物的增加积累。(3)为了解析柳枝稷中MTHFR单基因重度干扰无法获得再生苗的原因,构建了拟南芥MTHFR基因部分或完全缺失的双突变体。表型及分子鉴定表明MTHFR基因部分缺失(约50%残留活性)可维持拟南芥正常生长,完全缺失无法在后代中获得纯合体幼苗,与柳枝稷中结论一致。对杂合双突变体进行遗传分析:自花授粉后,种子发育及后续种子发芽、幼苗生长均正常,表明其为非胚胎及幼苗致死;自交后代分离比统计表明其为配子体致死;正反交统计表明其为雄配子体致死;花粉粒出现缩小、干瘪现象,花粉活性降低约50%,表明MTHFR基因完全缺失引起拟南芥雄性不育,最终导致无法获得种子。本研究首次揭示了MTHFR基因在柳枝稷及拟南芥中未知的生理功能,具有重要生物学意义,也为研究Cl途径和次生代谢途径的网络互作提供理论依据。