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杨树分布广,适应性强,不仅是重要的经济树种,还在水土保持和维护生态平衡方面发挥重要作用。杨树生长周期短,离体操作容易,基因组相对较小,是根癌农杆菌的天然宿主,是研究木本植物分子生物学和林木基因工程的模式植物。在杨树苗圃育苗中,杂草严重影响其产量和品质,抗除草剂Bar基因是基因工程研究中常用的目的基因和选择标记基因,研究杨树组织培养再生体系和除草剂Bar基因的遗传转化,可为杨树组织培养工厂化育苗和杨树基因工程的研究提供理论和技术基础。 本试验以杨树优良品种 84K 杨为受体,探讨了在 84K 杨再生过程中,各种因素对 84K 杨组织培养再生体系的影响,旨在建立具有良好的稳定性和重复性,易于再生,有很高再生频率的植物基因转化受体系统,为提高 84K 杨再生效率和遗传转化效率提供理论基础。将真核表达载体转入农杆菌中以获得工程菌,并在此基础上通过农杆菌介导法试图将抗除草剂 Bar 基因转入 84K 杨中,并对 84K 杨遗传转化体系做了深入的研究,旨在选育出抗除草剂杨树新品种,为工厂化育苗建立基础,并为研究杨树及木本植物的遗传转化,基因结构和表达等分子生物学内容提供很好的研究材料和理论基础,具有重要的理论和现实意义。试验研究结果如下: 1. 建立了腋芽直接萌发的快速增殖方法。确定了 84K 杨腋芽增殖的最适外植体为一年生嫩茎段,最适培养基为 MS+6-BA 2.0mg/L+ NAA0.5mg/L,为快速获得试管苗和叶片不定芽的诱导提供了前提,并为保持 84K 杨优良无性系遗传特性提供了基础。 2. 建立了 84K 杨叶片不定芽直接分化体系。84K 杨叶片外植体不定芽直接分化的最佳外植体是从继代 3 次以内的试管苗上所取的叶片,最佳培养方式是不经过暗培养直接在光/暗 14/10h 条件下培养,叶片不定芽直接分化的最佳培养基是初期在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L 上 培 养 , 待 芽 长 到 1cm 左 右 , 可 转 到MS+KT1.0mg/L+NAA0.1mg/L 上进行不定芽的壮苗培养。84K 杨叶片不定芽直接分化系统的建立,为 84K 杨基因转化提供了一种良好的受体系统,并为外源基因的稳定遗传提供基础。 3. 进行了84K杨不定芽生根的研究,大量元素减半的1/2MS培养基、7g/L的琼脂浓度、20g/L的蔗糖浓度是84K 杨生根的最佳浓度。不加任何激素的1/2MS培养基和1/2MS+NAA0.2mg/L+ IBA0.5mg/L是最佳的生根培养基,此时生根率和移栽成活率都较高。84K杨不定芽生根系统的建立,为转基因植株的生根提供了基础。 4. 通过三亲杂交法将真核表达载体 pBI121-Bar 转入根癌农杆菌 LBA4404 中,为 Bar基因转化及农杆菌转化提供前提条件。 5. 确定了在农杆菌叶盘法基因转化过程中,适宜的脱菌剂、选择剂浓度。适宜的脱菌剂为 Cef,最佳脱菌浓度为 400mg/L;抗性芽筛选选择压强度为 2mg/L PPT,抗性芽生根筛选选择压强度为 8mg/L PPT。 6. 系统地研究了影响农杆菌转化效率的各种因素,得到一条最佳转化途径。叶片在不定芽分化培养基上预培养 3~5 天;农杆菌培养至对数生长期,用 MS 液体培养基重新稀释悬浮培养,调整菌液浓度为 OD600 值为 0.3~0.5;侵染叶盘组织约10~15min;AS 加入共培养基中可促进转化效率,且最佳浓度为 AS 在共培养基中的终浓度为 500μmol/L,共培养时间 2~4d;然后在选择培养基进行选择培养。最佳转化途径的确定,为基因转化效率的提高和 84K 杨中其它基因的转化提供了技术基础。 7. 共获得 34 个 PPT 抗性芽, PCR 分子检测,有 6 株呈阳性反应植株,基因转化率为 1.72%。