目的人体内骨代谢稳态的维持有赖于骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨成脂分化的动态平衡。在外源性糖皮质激素作用下,骨代谢稳态被打破,经各种病理生理变化后逐渐发展为股骨头坏死。本研究旨在调查激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的数目和功能是否异常,并探讨其中Wnt信号通路的变化情况。方法选择2011-2012年就诊22例激素性股骨头坏死患者,25例股骨颈骨折患者。经患者知情同意与武汉协和医院伦理委员会审批后,在手术室无菌条件下抽取患者股骨骨髓5ml。经密度梯度离心法体外分离、培养MSCs,贴壁细胞传代,取第三代细胞,流式细胞仪进行表面标记物鉴定。22例患者及25例对照均观察骨髓间充质干细胞的集落形成能力,选取每组年龄相匹配的10例分别检测细胞活力、细胞周期、线粒体膜电位水平、细胞内活性氧水平、细胞成骨和成脂分化能力以及Wnt通路的活性和关键因子的表达水平。结果激素性股骨头坏死组骨髓间充质干细胞的集落形成能力较股骨颈骨折组显著下降(19.6±7.7vs.262±6.2,P<0.001)。激素性骨坏死组的线粒体膜电位水平明显低于股骨颈骨折组,而活性氧水平高于股骨颈骨折组(P<0.05)。激素性股骨头坏死组骨髓间充质干细胞成骨能力显著低于股骨颈骨折组,而成脂分化能力则显著增强。免疫荧光显示Wnt通路上关键因子FZD1、β-catenin在激素性股骨头坏死MSCs上表达明显减弱,LiCL干预后能上调其表达,Wnt通路拮抗因子DKK1的表达则刚好相反。表明激素性股骨头坏死组MSCs中Wnt通路活性明显受抑制,PCR和western blot结果也证实了这点。结论激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞数量和功能均下降,Wnt通路活性明显受抑制。激素通过改变骨髓间充质干细胞的生物学性能并最终引起骨代谢失衡、股骨头坏死。目的表观遗传调控在干细胞分化过程中具有十分重要的作用。干细胞在从全能性至终末分化的每一阶段,都需建立稳定的表观遗传状态。在人类疾病中,研究最多的表观遗传机制是基因组DNA甲基化修饰。本研究观察激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞基因组DNA的甲基化状态及其对MSCs功能失调的影响,并探讨其中的机制。方法选择2012-2013年就诊20例激素性股骨头坏死患者,22例股骨颈骨折患者。经患者知情同意与武汉协和医院伦理委员会审批后,在手术室无菌条件下抽取患者股骨骨髓5ml。经密度梯度离心法体外分离、培养MSCs,贴壁细胞传代,取第三代细胞,流式细胞仪进行表面标记物鉴定。LUMA技术检测22例患者、20例对照组MSCs及5’-氮杂胞苷(5’-Aza-dC)干预后的MSCs全基因组DNA整体甲基化情况,然后着重对干性基因(Oct、Nanog)和ABCB1基因启动子区CpG岛进行亚硫酸氢盐测序。同时实时定量PCR和WESTERN BLOT检测Oct4、Nanog、ABCB1、Runx2、PPAR-γ/osteocalcin等在转录和翻译水平的表达情况。检测三组细胞增殖能力、线粒体膜电位水平、细胞内活性氧水平、细胞成骨和成脂分化能力。结果对三组MSCs全基因组DNA整体甲基化情况进行LUMA检测后发现激素性股骨头坏死组MSCs全基因组DNA整体甲基化率要明显高于对照组,5’-氮杂胞苷干预后整体甲基化率降低。亚硫酸氢盐测序进一步显示激素性股骨头坏死组MSCs的Oct4/Nanog和ABCB1基因启动子区的甲基化水平明显高于对照组。15μM5’-Aza-dC能在一定程度上促进激素性骨坏死组MSCs的增殖能力。激素性骨坏死组MSCs的线粒体膜电位水平明显低于股骨颈骨折组,15μM5’-Aza-dC干预后线粒体膜电位明显上升,并且其变化具有浓度依赖性。而活性氧水平高于股骨颈骨折组(P<0.05),15μM5’-Aza-dC干预后活性氧明显降低。15μM5’-Aza-dC能一定程度上恢复激素性股骨头坏死组MSCs成骨与成脂分化的动态失衡。实时定量PCR和WESTERN BLOT检测示：激素性股骨头坏死组MSCs的Oct4、Nanog、ABCB1、Runx2、PPAR-γ、 osteocalcin等基因在转录和翻译水平上较股骨颈骨折组均明显下调,15μM5’-Aza-dC能一定程度上上调这些基因的表达水平。结论激素性股骨头坏死患者MSCs全基因组DNA存在过甲基化修饰,其中干性基因Oct4、Nanog和ABCB1基因的过甲基化修饰使MSCs丧失干性表型及自我防御能力,进而导致生物学功能失调并最终引起骨代谢失衡,股骨头坏死、塌陷。目的探讨利用重编程的骨髓间充质干细胞治疗大鼠激素性股骨头坏死的有效性及其机制。方法雄性SD大鼠40只,随机分为空白对照组、实验对照组、重编程的MSCs治疗组和普通MSCs治疗组,每组10只。后三组分别进行肌注醋酸泼尼松龙25mg/kg体重,每周2次,总共4周；空白对照组进行等体积的生理盐水肌肉注射。然后选两侧股骨髁间窝作为入路,克式针钻孔到股骨颈。两治疗组分别予以5’-氮杂胞苷(5’-Aza-dC)干预的MSCs和未干预的MSCs局部输入,明胶海绵封闭孔道,实验对照组注入等量的生理盐水。术后八周取股骨头进行病理组织学检测。结果成功分离培养出了大鼠骨髓MSCs,高表达CD44、CD90,低表达CD45。造模组MSCs增殖能力明显弱于对照组,5μM5’-Aza-dC促进激素性骨坏死组MSCs的增殖能力最强,同时能恢复MSCs干性基因OCT4、NANOG和ABCB1的表达以及成骨分化能力。股骨头切片HE染色示：重编程的MSCs治疗组空骨陷窝率明显低于实验对照组和普通MSCs治疗组,但较空白对照组稍高。TUNEL、DKK1染色示：重编程的MSCs治疗组染色阳性率明显低于实验对照组和普通MSCs治疗组,但较空白对照组稍高。PCNA、β-catenin染色示：重编程的MSCs治疗组染色阳性率明显高于实验对照组和普通MSCs治疗组,但较空白对照组稍低。结论重编程的MSCs能有效防治大鼠早期激素性股骨头坏死,同时激活Wnt信号通路。