落新妇为虎耳草科植物落新妇Astilbe chinese(Maxim.) Franch.et Sav.的根茎，为较常用的草药，广泛分布于我国南北各地区，资源十分丰富。民间俗称“黑芨”，用以治疗各种恶性肿瘤。本实验室以体外抗肿瘤实验为导向，从落新妇根茎中定向追踪筛选分离得到5个具有显著抗肿瘤活性的五环三萜类化合物，分别命名为ATA、ATB、ATC、ATD和ATE，其中以ATA活性最显著。本课题研究发现，与人宫颈癌HeLa细胞和人结直肠癌COLO205细胞相比，ATA对HepG2细胞更为敏感。目前，对天然药物抗肿瘤的研究，已迈入分子生物学的研究时代，分子水平研究成果正逐渐揭开天然药物抗肿瘤作用的神秘面纱，不仅为临床应用抗肿瘤中药提供充分的理论依据，而且为天然药物抗肿瘤指明了研究的方向。本课题为了深入地探讨ATA的抗肿瘤作用途径，选取HepG2细胞为研究对象，先从诱导凋亡和阻滞细胞周期方面，分析ATA对HepG2细胞的抑制作用。随后，采用美国SA Biosciences公司新一代功能性基因芯片Human Cancer Pathway Finder PCRArray，从基因水平上全面地分析ATA作用HepG2细胞的显著差异表达基因，并采用RT-PCR对PCR芯片结果进行验证。同时，根据PCR芯片结果，进一步进行了ATA抗黏附、抗侵袭和抗转移作用研究，并结合PCR芯片结果，深入地讨论ATA的抗肿瘤作用途径。　　 1.ATA对HepG2细胞凋亡及细胞周期的影响　　 采用MTT法测定了ATA对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用。结果显示，ATA能显著抑制HepG2细胞的增殖，并呈浓度和时间依赖性关系。　　 细胞凋亡具有一系列典型的形态学特征和生化特征。本实验采用吖啶橙AO和JC-1染色，荧光显微镜和流式细胞仪分析了ATA对HepG2细胞形态和线粒体跨膜电位的影响。结果表明:HepG2细胞经ATA处理后，细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光，甚至可见浓染的黄绿色荧光，并出现凋亡小体和空泡，呈典型的细胞凋亡形态学变化;ATA能显著地降低HepG2细胞的线粒体跨膜电位，并随着时间的延长和浓度的增加，作用逐渐增强呈。线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡早期的一个标志性事件。因此，这些结果表明:ATA可诱导HepG2细胞凋亡。　　 为了进一步探讨ATA诱导HepG2细胞凋亡的作用机制，采用RT-PCR法分析凋亡相关基因的mRNA表达变化。结果表明:ATA能显著上调HepG2细胞Caspase-8、Fas和Caspase-9、bak、bax和bad的基因表达，下调Bcl-w的mRNA表达。可见，ATA可通过死亡受体通路和线粒体通路共同诱导细胞凋亡。　　 细胞凋亡常伴随有细胞周期的阻滞。流式细胞仪测定ATA处理HepG2细胞周期分布，并采用RT-PCR法分析细胞周期相关基因表达变化。结果表明，ATA可上调p53和p21基因表达，通过p53介导途径，阻滞HepG2细胞于G2期。　　 2.ATA作用HepG2细胞的显著差异表达基因　　 为了全面深入地探讨ATA的抗肿瘤作用途径，采用Cancer Pathway Finder PCR芯片检测ATA对HepG2细胞基因表达的影响，并采用RT-PCR方法对7个显著差异表达基因（含4个上调基因和3个下调基因）进行验证，证实了PCR芯片结果的可信性。　　 PCR芯片结果显示:HepG2细胞经ATA处理后，涉及肿瘤发生和发展六条生物学通路代表性84个功能性基因中，约20个基因表达水平发生了显著的变化，其中9个基因表达显著性上调，11个基因表达下调。这些基因涉及细胞的凋亡、周期、信号转导及转录因子、血管生成和侵袭转移等通路。其中，细胞周期和凋亡相关的显著差异表达基因约占显著差异表达基因总数的35％，信号转导及转录因子约占12％，其余53％涉及侵袭转移及血管生成。细胞凋亡及周期相关的基因的表达变化，生物信息学分析结果表明:ATA诱导HepG2细胞凋亡和阻滞细胞周期的作用，可能通过MAPK和Akt信号转导通路。纵观所有显著差异表达基因，侵袭转移及血管生成相关基因所占的比例最大，而且上调或下调差异最显著的基因，也多为侵袭转移及血管生成相关基因以及信号转导分子和转录因子。这提示我们，与影响细胞凋亡和周期途径相比，ATA对HepG2细胞的侵袭转移及血管生成途径的影响似乎更为显著。　　 3.ATA对HepG2细胞黏附、侵袭和转移力的影响　　 局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最主要的生物学特性，是临床治疗失败和影响预后的最主要因素。PCR芯片结果显示，ATA对HepG2细胞的抗肿瘤作用，与其抑制细胞的侵袭转移及血管生成有紧密联系。因此，采用黏附试验、Transwell实验和划痕损伤实验，分别测定ATA对HepG2细胞的黏附、侵袭和转移能力的影响。结果表明，ATA可显著降低HepG2细胞黏附、侵袭和转移的能力。　　 结合PCR芯片结果可知，ATA能下调HepG2细胞外基质降解酶MMP-9、uPA、以及促血管生成因子ANGPT1、TEK和TGFBR1等基因的表达，上调抑血管因子THBS1基因的表达;同时，ATA处理的HepG2细胞免疫调节因子TNF、 IL-8和信号转导因子c-Jun基因表达上调，而另一信号转导因子Akt的表达则显著下调。这些结果表明，ATA可能通过Akt与MARK信号转导通路，降低细胞的黏附性、阻滞细胞外基质降解、抑制血管生成和增强免疫调节等作用，从而发挥对HepG2细胞抗侵袭转移作用。