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猴头菇(Hericium erinaceus)是一种著名的食药用真菌,其性平、味甘、入药利五脏、助消化,可治疗神经衰弱、胃炎及胃溃疡等。猴头菌多糖是其最主要的活性成分之一,具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种功效。本课题组前期从猴头菌中分离获得一种具有体外免疫活性的大分子β-葡聚糖H6PC20,由于此多糖粘度较大,在水中的溶解度不高,从而限制了其深度开发利用。采用物理或化学方法对其进行适当的降解改性或化学修饰,制备溶解性好、活性更高的多糖衍生物,将会扩大该多糖在食品、保健品乃至药品的开发应用。本论文利用超声降解和酸水解的技术手段对猴头菌大分子β-葡聚糖进行降解改性,对降解工艺进行优化,并采用化学分析、波谱分析和现代仪器分析技术对改性前后的猴头菌多糖一级结构、糖的空间构象进行研究比较,结合体外免疫活性探讨了其结构与活性之间的相关性,为进一步研究多糖的构效关系和计算机模拟多糖的空间构象奠定了基础。具体研究内容分以下几部分:1、超声降解猴头菌大分子β-葡聚糖的制备工艺和体外活性研究以猴头菌大分子量多糖H6PC20为原料,利用超声波技术对其进行降解,分别考察了超声时间、多糖浓度、超声作用强度对其超声降解效果的影响,并对降解后的多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性进行研究,筛选出活性好、分子量小、溶解度高的多糖组分UH6PC20。超声降解后多糖的溶解性显著提高,由原来的3g/L提高到30.2g/L;分子量由原来的2.39×10~6降到2.80×10~5Da,可以降低一个数量级;降解前的多糖含量为94.99%、降解后的多糖含量为94.72%,多糖含量基本没有改变。2、猴头菌大分子多糖超声降解前后的化学结构及构象变化研究经高效阴离子色谱分析,猴头菌大分子β葡聚糖降解前后单糖组成没有发生改变,均为葡萄糖;甲基化实验表明H6PC20和UH6PC20的糖残基(末端:1-3和1-3-6)的比例分别为1:2.56:0.9和1:2.45:0.97;IR扫描表明超声降解并未涉及到主要的官能团;NMR检测可进一步推测各组分多糖均是在C6上分支的β-(1→3)-D-吡喃葡聚糖主链结构,说明超声处理对多糖的连接方式及一级结构重复单元没有产生明显影响;通过刚果红实验,结果发现在Na OH浓度为0～0.2mol/L时多糖与刚果红发生络合,最大吸收波长发生红移,且UH6PC20较H6PC20最大吸波长红移更明显,表明降解前后的多糖均具有三股螺旋结构;碘-碘化钾实验表明,降解前后的多糖均具有较多的支链或者有较长的链;利用尺寸排除色谱-多角度激光光散射仪-示差折光仪-毛细管粘度仪(SEC-MALLS-RI-Visco)四联用装置成功表征了猴头菌葡聚糖在稀溶液中的行为,H6PC20的α值为0.354,表明为典型的高支化结构,超声后多糖UH6PC20的α值增大为1.17,为棒状结构,超声后多糖发生了降解,其在溶液中的聚集状态被破坏,分子构象从舒展的高支化结构向棒状结构转变;通过扫描电镜(SEM)观察到降解前的多糖呈大片的片状结构,降解后的多糖已经出现了规则排列的棒状聚集体说明超声波降解改变了多糖的聚集状态,使多糖更有规律的排列;通过原子力显微镜(AFM)观察到糖链的平均链长为329.43nm和50.72nm,平均链长变短;用XRD考察其晶体学信息,在2θ为20°左右时,多糖样品有一个“鼓包样”的衍射峰,晶粒大小分别为1.65nm和1.98nm,观测到多糖的晶粒大小分别为1.7nm左右,可进一步证实多糖中存在三螺旋的空间构象,但是降解过后的峰低于降解前的结晶峰,结晶度降低;圆二色谱分析表明超声不会改变多糖的cotton效应,降解后的活性增强可能与多糖的空间构象的变化有关。3、酸降解猴头菌大分子β-葡聚糖的制备工艺和体外活性研究利用不同的酸对H6PC20进行降解研究,结果表明,柠檬酸的降解效果差、后续处理较为繁琐;稀盐酸和稀硫酸降解多糖后得到的分子片段较多,且各个组分之间较难分离;三氟乙酸(TFA)降解多糖时得到的组分较为简单,且易于分离。初步优选了三氟乙酸对多糖进行降解,随着降解时间的延长、三氟乙酸浓度的增加,大分子量多糖的比例减小,免疫活性降低,DPPH清除率增加,降解的小分子片段的多糖或寡糖增加,而分子量相对大的多糖组分减少,由于具有免疫活性的多糖通常具有相对大的分子量(>1×10~5Da);而小分子量的多糖抗氧化活性更强,这一结果也说明多糖的活性与其分子量具有很大的相关性。4、不同菌株来源的猴头菌大分子多糖的分析比较对12个不同猴头菌菌株固体发酵和液体发酵产生大分子多糖的差异进行了分析,研究表明,不同品种产生的多糖差别较大,固体发酵菌丝体产生的多糖以0627和0608菌株含量最高,为0.3%;液体发酵菌丝体产生的多糖以0605菌株含量最高,为2.89%;基于不同品种多糖的HPSEC和HPAEC图谱分析,构建了可表征猴头菌多糖分子量分布和单糖组成的指纹图谱。对固体发酵菌丝体和液体发酵菌丝体多糖刺激巨噬细胞产生NO的作用进行研究,发现“古田”菌株固体发酵菌丝体多糖的活性最好,“华中”菌株液体发酵菌丝体多糖的活性最好,不同菌株产生的多糖活性差异与其单糖组成和分子量大小的不同有一定相关性。