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[目的] 人脑髓鞘碱性蛋白（Human Brain Myelin Basic Protein，MBP）是神经组织特有的蛋白质，由中枢神经系统（CNS）少突细胞和外周神经系统（PNS）雪旺氏细胞（SC）合成，占髓鞘蛋白质总量的30％，在神经纤维的绝缘和快速传导中发挥重要作用。MBP具有种属、组织细胞特异性和时空表达阶段特异性，对人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成具有重要生理作用。MBP不仅存在于神经组织，而且广泛分布于造血系统，其功能未知。MBP还具有自身免疫原性，与完全福氏佐剂混合免疫动物能诱发实验性变应性脑脊髓炎（EAE），是人类自身免疫性疾病多发性硬化（MS）的良好动物模型；口服MBP则导致口服耐受，是治疗MS等脱髓鞘疾病的重要手段。在神经科学领域中，MBP及其基因的研究起步早、进展快，迄今仍是人们关注的焦点之一。MBP在神经细胞的生长、发育和分化过程中究竟是促进细胞生长、增殖或是抑制生长、诱导细胞凋亡?这方面的有关研究报道目前国内外甚少，且尚存争议。弄清楚MBP对细胞增殖和凋亡的确切作用，不仅对人脑发育、神经细胞分化、髓鞘发生与髓鞘形成等基础研究具有重要意义，而且对CNS疾病发病机理与诊治等临床研究无疑具有广泛应用价值。为此，本课题在前期系列微基因构建的基础上，应用我室构建的含人Ⅰ型胶原基因调节元件（COLIA1）-MBP cDNA微基因，经LipofectAMINETM介导转染人成纤维细胞（FB）、动脉平滑肌细胞（SMC）和云南锡矿工肺癌细胞（YTMLC-90），同时转染含人神经生长因子（NGF）和人脑源性神经营养因子（BDNF）的微基因pSVCEP-NGF-CAT、pSVCEP-BDNF-CAT的细胞为阳性对照，转染空载体pSVCEP-CAT的细胞为阴性对照。通过细胞形态和微结构改变的观察、MTT增殖曲线测定、ELISA检测、流式细胞分析、DNA琼脂糖电泳、免疫细胞化学分析、免疫狭缝杂交、Western杂交和TUNEL原位杂交等多种方法，从细胞与分子水平观察和研究了MBP、NGF和BDNF等外源基因经COLIA1驱动在非神经细胞中异位表达及其四川大学博士论文对细胞增殖和凋亡的影响。〔方法〕1 .MBP、BDNF或NGF微基因修饰FB、SMC、YTMLC一90的建立:碱裂解法提取pSCEP一MBP一CAT、PSVCEP一NGF一CAT、pSVCEP一BDNF一CAT及psvCEP一CAT质粒DNA，脂质体LipofeetAMINE仪介导转染FB、SMC和YTMLC一90，经G418筛选获得MBP、BDNF和NGF微基因修饰FB、S光、YTMLC一90。2.MBP、BDNF和NGF微基因在FB、SMC、YTMLC一90中表达的鉴定:0.25%胰蛋白酶消化收集1 x10“个细胞，提取细胞总蛋白质，采用Western杂交和ELISA分别定性、定量检测FB、S毗、YTMLC一90中MBP、BDNF及NGF的异位表达，免疫细胞化学方法确定FB、SMC、YTMLC一90中MBP的表达定位。3.MBP、BDNF和NGF微基因修饰FB、SMC、YTMLC一90细胞生长与凋亡的鉴定:各类细胞分别在转染MBP、BDNF和NGF微基因前后，采用系列技术如MTT法检测细胞增殖存活率，DNA琼脂糖电泳分析细胞DNA断裂的梯型（Ladder）图，TUNEL原位荧光标记显示单个凋亡细胞数，显微镜Giemsa染色和叮咙橙荧光染色（AO）以及透射电子显微镜观察细胞形态及其超微结构变化，流式细胞术（FCM）测定细胞凋亡率;同时，检测HZOZ、肿瘤坏死因子一a（TNF-a）和Anti一BP对MBP微基因修饰FB、SMC、YTMLC一90细胞增殖与凋亡的影响。〔结果〕1 .PSCEP一MBP一CAT、PSVCEP一NGF一CAT、PSVCEP一BDNF一CAT及PSVCEP一CAT质粒DNA的提取、酶切和表达鉴定: 碱裂解法提取pSCEP一MBP一CAT、pSVCEP一NGF一CAT、pSVCEP一BDNF〔AT及pSVCEP一CAT重组质粒DNA，分别经EeoRI/Hindlll、Sall/Hindlll、Hind 111/BafnHI酶图谱分析证实，含600bp MBP、390bp刀一NGF、760bpBDNF eDNA插入片段。含pSCEP一MBP一CAT、pSVCEP一NGF一CAT、pSVCEP一BDNF一AT的转化宿主菌J’Ml09，经工PTG诱导培养，菌体裂解四川大学博1:论文液经免疫狭缝杂交显示上述目的基因分别在宿主菌中得到成功表达。2.人21.5 kDa MBP及BDNF、NGF微基因修饰FB、SMC、YTMLC一90的建立和细胞内目的基因的表达鉴定: 提取pSCEP一MBp一CAT、pSVCEP一NGF一CAT、pSVCEP一BDNF一CAT及psvCEP一CAT质粒oNA，经Lip。feetAMINE「明介导分别转染FB、SMe及YTMLC一90，细胞裂解液经ELISA和Western分析，证明MBP、NGF、BDNF各目的基因分别在FB、SMC及YTMLC一90中成功异位表达，免疫细胞化学染色分析证实表达产物具MBP特异抗原活性并显示21.skDaM即的表达定位于细胞核和胞浆中。3.人21.skDa MBP及隅F、BDNF对细胞增殖与凋亡的作用研究: （l）MTT法研究显示，2 1 .skDa MBP以及NGF和BDNF对FB、SMC及YT讹C一90三种细胞的增殖均有明显的促进作用;200一800娜ol/L HZO:处理FB、SMC及YTMLC一90明显抑制细胞生长、诱导细胞凋亡，且具有显著的剂量依赖性和时间依赖性;与空载体转染细胞相比，21.skDa MBP、NGF和BDNF微基因修饰细胞具有明显的抗凋亡作用:此外，21.skDa毗P微基因修饰细胞对TNF一a诱导的细胞凋亡有明显的抑制作用，用MBP抗体 （Anti一MBP）封闭MBP后其抗凋亡活性随即消失。 （2）Giemsa染色显