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谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质,一方面,它从突触前膜释放到突触间隙,作用于突触后膜,传递兴奋性信号,维持正常的细胞信号转导;另一方面,它是一种潜在的神经毒素,释放到突触间隙的谷氨酸发挥效应后需要及时回收入细胞内,否则蓄积的高浓度谷氨酸会产生兴奋性毒性效应。由于缺乏谷氨酸代谢酶系统,释放到突触间隙的谷氨酸主要依靠突触前膜及神经胶质细胞上的兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAATs)摄取回收。因此EAATs对兴奋性突触信号的终止,正常兴奋性传导的维持,兴奋性中毒的预防有重要意义。研究显示EAATs功能失调与多种神经退行性疾病相关,它的结构、功能及转运机制的研究可能给临床上这些疾病的预防和治疗提供线索,因此阐明EAATs转运机制显得尤为重要。EAATs主要通过自身构象不断发生改变来完成底物和离子的转运,它在底物转运循环三维空间构象的变化过程(包括如何与底物和离子结合与解离,参与位点等)是转运机制的研究重点。EAATs的晶体结构解析有一定难度,但其原核生物同源体GltPh的晶体结构可用作EAATs研究的参考模板。研究表明,GltPh羧基端和氨基端分别形成两个区:转运区和三聚体界面。转运区主要由发夹结构(helical hairpin,HP)1、HP2和跨膜区段(transmembrane domain,TM)7、TM8组成,这几个区段参与底物及离子结合位点的构成,并且HP1、HP2分别作为控制底物结合和解离的细胞内外闸门。整个转运区在底物转运过程向胞内运动并发生旋转;而TM2、TM4和TM5组成的三聚体界面在转运循环中趋于静止,起维持平衡的作用。关于EAATs转运区内各区段在底物转运过程中构象改变的研究很多,但是转运区和三聚体界面之间的构象变化研究很少。我们首先分析了 EAATs底物转运过程中转运区与三聚体界面之间的构象变化关系,完善了 EAATs的转运机制。然后进一步分析TM4区段在转运底物过程中的构象改变,揭示真核TM4区段在转运循环中所负功能。第一章GLT-1底物转运过程中TM5与HP2的相对运动我们首先研究胶质细胞谷氨酸转运体(glial glutamate transporter-1,GLT-1)转运区与三聚体界面之间的构象改变。之前的研究表明HP2作为细胞外闸门参与底物和离子的转运;TM5区段部分位点参与转运通道的组成。本课题中我们首先研究TM5与HP2之间的构象变化关系。在TM5和HP2上挑选位点配对,构建了 I283C/S443C和S287C/S443C突变体。然后加入氧化剂Copper(Ⅱ)(1,10-Phenanthroline)3(CuPh)孵育,检测它对突变体底物摄取功能的影响。结果发现CuPh作用后I283C/S443C和S287C/S443C对底物的摄取减少,而其它对照组的底物摄取功能不受影响,说明这两对突变体的两个半胱氨酸之间形成了二硫键,并且这个二硫键的形成只发生在同一个单体内。加入还原剂二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)孵育后 I283C/S443C 和 S287C/S443C 的转运活性有所恢复,这反向验证了二硫键的形成。动力学参数检测结果显示,CuPh孵育后I283C/S443C和S287C/S443C与底物的亲和力降低,并且I283C/S443C转运功能受损。至此我们推测这两对位点在空间距离上十分邻近。然后加入不同的细胞外介质,检测它们对CuPh氧化抑制效应的影响。不同细胞外介质对I283C/S443C和S287C/S443C转运活性的影响不同。在加入底物谷氨酸(L-glutamate,L-glu)或K+,使转运体向胞内开放比例增加时,CuPh对I283C/S443C转运活性抑制效应减弱,对S287C/S443C转运活性抑制效应进一步增强。加入底物非转运性抑制剂D,L-threo-β-benzyloxyaspartate(DL-TBOA)对两者转运活性影响不大。加入非透膜性疏基试剂(2-trimethylammonium)methanethiosulfonate(MTSET),检测各个位点的水相通透性。S287C对MTSET不敏感,各时相水相通透性变化不大。I283C和S443C水相通透性变化一致:在转运体向胞内开放时相比例增加时,二者水相通透性降低。综上,我们认为GLT-1转运底物过程中TM5区段和HP2区段之间发生了复杂的相对运动:HP2向胞内运动并不仅仅是简单的直线运动,而是伴随着旋转,旋转方向为偏离TM5上Ile-283位点。而之前根据GltPh晶体学结构模拟计算,发现GltPh上分别对应于GLT-1的Ile-283和Ser-443位点的Val-201和Gly-357位点之间的距离在从胞外开放时相向胞内开放时相转变时减少了18A,这也说明EAATs在转运底物过程中的构象改变与其原核生物同源物相比并不完全相同。第二章EAAT1底物转运过程中转运区与三聚体界面的相对运动我们知道,三聚体界面除了 TM5区段外还包括TM2和TM4区段,那么三聚体界面的其它区段构象改变及功能如何?TM2区段与细胞内闸门HP1之间的相互运动关系已经进行过研究,本课题中我们进一步研究EAAT1三聚体界面的TM4区段与转运区的细胞内外闸门HP1、HP2之间的位置变化关系。首先,我们在TM4区段和HP1及HP2的顶端挑选位点进行配对,构建了三对双半胱氨酸突变体:A243C/S366C、A243C/I453C 和 A243C/T456C。然后加入氧化剂 CuPh或Cd2+孵育,检测它们对突变体底物摄取功能的影响。结果表明,氧化剂CuPh或 Cd2+孵育后,A243C/S366C、A243C/I453C 和 A243C/T456C 这三对双半胱氨酸突变体的底物摄取功能都降低,而其他单半胱氨酸突变体组、单半胱氨酸突变体共转染组等对照组的底物摄取功能不受影响。这说明这三对突变体的两个半胱氨酸之间形成了二硫键,并且这个二硫键的形成只发生在同一个单体内。加入还原剂DTT孵育后,这三对突变体的底物摄取功能都有所恢复,这反向验证了二硫键的形成。动力学参数检测结果显示,CuPh孵育后A243C/S366C、A243C/I453C和A243C/T456C的转运功能受损,并且A243C/I453C与底物的亲和力降低。至此我们推测这三对位点在空间距离上十分邻近。然后加入不同的细胞外介质,检测它们对氧化剂抑制效应的影响。在加入底物L-glu或K+,使转运体向胞内开放比例增加时,CuPh对A243C/S366C底物摄取功能的抑制效应减弱;在加入DL-TBOA,使转运体向胞外开放比例增加时,CuPh对A243C/S366C底物摄取功能的抑制效应增强。这说明转运体从向胞外开放时相转变到向胞内开放时相时,Ala-243位点与Ser-366位点的空间距离增加。然而,对于A243C/I453C和A243C/T456C而言,无论在转运体向胞外开放时相还是在转运体向胞内开放时相,Ala-243位点与Ile-453及Thr-456位点的空间距离都很远。检测单个位点的水相通透性,发现A243C在各时相均暴露于液相环境中,但各时相的水相通透性变化不大。而S366C、I453C和T456C在转运体向胞内开放时相的水相通透性都降低。综上,我们推测EAAT1在底物转运过程中,转运区相对三聚体界面发生了复杂的相对运动:从胞外开放向胞内开放变构时,HP1向胞内运动,因此HP1上Ser-366位点与TM4区段的Ala-243位点的空间距离变远;同时HP2也向胞内运动,但是相对GltPh而言,EAATs的HP2区段向胞内运动的程度更深,或者HP2向胞内运动的同时发生了旋转,最终导致HP2顶端Ile-453和Thr-456位点与TM4区段Ala-243位点的距离变远。研究表明,EAATs的TM4区段比其原核同源物GltPh多了 50几个氨基酸,这可能造成真核TM4区段与原核之间存在较大差异,因此我们推测也有可能是真核TM4区段参与到底物转运过程,在转运循环中位置发生偏移或者构象发生改变,导致Ala-243位点与Ile-453和Thr-456位点空间距离增加。第三章GLT-1的TM4区段功能分析上一部分的研究推测EAATs的TM4区段可能参与底物转运。为了进一步验证这一结论,我们对GLT-1的TM4区段进行功能分析。真核谷氨酸转运体TM2区段的氨基酸数目与其原核同源体相同,提示真核TM2区段在转运底物过程中的构象改变与原核生物转运体一致,因此TM2在转运底物过程中的空间位置倾向于保持不变。我们进一步探究GLT-1转运底物过程TM4区段和TM2区段之间的位置变化关系。首先,我们在GLT-1的TM2区段和TM4区段挑选位点进行配对,构建了两对双半胱氨酸突变体:I93C/V241C和I97C/V241C。然后加入氧化剂CuPh或Cd2+孵育,检测它对突变体底物摄取功能的影响。结果发现,CuPh或Cd2+孵育后,I93C/V241C和I97C/V241C的底物摄取功能都降低,而其它对照组的底物摄取功能不受影响。这说明这两对突变体的两个半胱氨酸之间形成了二硫键,并且这个二硫键的形成只发生在同一个单体内。加入还原剂DTT后,这两对突变体的底物摄取功能有所恢复,这反向验证了二硫键的形成。动力学参数检测结果显示,CuPh孵育后I93C/V241C和I97C/V241C的转运功能及与底物的亲和力均受损。至此我们推测这两对位点的空间距离十分邻近。然后加入不同的细胞外介质,检测它们对氧化抑制效应的影响,不同细胞外介质对二者转运活性的影响一致。在加入L-glu或K+,使转运体向胞内开放比例增加时,CuPh对两者转运活性的抑制效应进一步增强。底物抑制剂DL-TBOA对二者转运活性影响不大。我们推测转运体从向胞外开放时相转变到向胞内开放时相时,Val-241位点与Ile-93及Ile-97位点之间的空间距离减少。检测各个位点的水相通透性,发现I93C和I97C对MTSET不敏感,在各时相水相通透性变化不大。而V241C对MTSET非常敏感,无论在向胞内还是向胞外开放时相,水相通透性都降低。Gltph上对应于GLT-1 I93/V241和I97/V241这两对位点的分别是V58/V151和V62/V151,GltPh晶体学结构模拟计算结果显示这两对位点之间的距离在从胞外开放向胞内开放转变时变化不大。综上,我们推测EAATs的TM4区段在底物转运过程中构象也发生了改变,可能是向某一方向运动,最终导致TM4区段的Val-241位点与TM2区段的Ile-93和Ile-97位点相互靠近。