青虾,学名日本沼虾(Macrobrachium nipponensis),是我国重要的淡水养殖品种。雌雄青虾生长差异显著,商品雄虾的平均规格为雌虾的2～2.5倍。因此,全雄化养殖可以大幅度提高青虾的产量和经济效益。性别控制技术是实现青虾单性化养殖的基础,而要实现青虾性别的人工控制,首先要确定性别决定基因及其调控机制,但有关研究几乎空白,制约了青虾性别控制技术的发展。促雄腺(androgenic gland,AG)是甲壳动物性别分化(雄性化)的关键器官,其分泌的胰岛素样促雄腺激素(insulin-like androgenic gland hormone,IAG)在甲壳动物的性别分化中起着关键作用。体外研究表明,胰岛素样促雄腺激素结合蛋白(insulin-like androgenic gland hormone binding protein gene,IAGBP)能特异地结合IAG激素,然而在甲壳动物体内IAG与IAGBP之间是否存在相互调控关系以及如何调控,迄今未见报道。另一方面,研究表明眼柄中的神经激素对IAG基因起着负调控作用,但具体那种(些)神经激素发挥作用尚不清楚。本文拟以青虾为研究对象,以促雄腺转录组文库为基础克隆青虾IAG和IAGBP的cDNA序列,并获得其基因组序列,在转录水平上研究了上述两个基因的相互调控关系;同时研究了神经激素—高血糖素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)、性腺抑制激素(gonad inhibiting hormone,GIH)和蜕皮抑制激素(molt inhibiting hormone,MIH)对IAG基因的调控作用,并克隆了它们的基因组序列;研究表明,IAG基因在甲壳动物的生长过程中起着生长调节因子的作用。因此本文在青虾IAG基因组内含子中进行了与生长性状相关的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)位点的筛选。1.青虾IAG和IAGBP基因的克隆及在发育过程和成体组织中的表达分析本文通过采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆青虾IAG和IAGBP的cDNA序列,并获得了其基因组序列。IAG基因的cDNA序列全长为1653bp,其中5’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)为222bp,开放阅读框为528bp、3’UTR为903bp,3’端有一个Poly(A)尾巴,加尾信号AATAAA位于Poly(A)尾巴的前端。青虾IAG多肽由一个信号肽(27个氨基酸)和一个前体多肤(148个氨基酸)组成。青虾IAG前体多肽由A链、B链和C链构成。其中B链有40个氨基酸,C链有65个氛基酸,A链有43个氨基酸。青虾IAG基因组序列存在两个基因拷贝,这两个基因拷贝均由5个外显子和4个内含子组成。两者的区别在于,第4内含子的长度有所不同。具体构成如下,IAG基因组序列Ⅰ全长5579bp(GenBank:KF811212),具体为:外显子1(27bp)、内含子1(1795bp)、外显子2(172bp)、内含子2(615bp)、外显子3(113bp)、内含子3(1193bp)、外显子4(183bp)、内含子4(1448bp)、外显子5(33bp);IAG基因组序列Ⅱ全长4739bp(GenBank:KJ831646),此序列第4内含子为608bp,其它的内含子和外显子长度与IAG基因组序列Ⅰ相同。分析内含子的序列发现,这两个基因组序列所有内含子的5’端有GT碱基和3’端存在AG碱基,属于"GT-AG"型内含子。IAG基因在检测的组织中仅在促雄腺和肝胰腺中表达。在促雄腺中的表达量最高,在肝胰腺中也有表达,表达量约为促雄腺表达量的1%。IAG基因在不同发育时期的表达结果为,在胚胎期表达最低,其次是出膜后期,表达量最高的是变态后期。具体而言,在胚胎期,从卵裂期到无节幼体期,表达量一直较低,蚤状幼体期表达量升高;在出膜后的表达量相对稳定;在变态后阶段最高的表达量出现在第10天(PL10),且从变态后第20天(PL20)到成虾表达量呈相对稳定上升趋势。IAGBP基因的cDNA序列全长为1085bp(GenBank:KJ831645),其中5’UTR为60bp,开放阅读框为759bp、3’UTR为266bp,3’端有一个Poly(A)尾巴。IAGBP多肽结构域分为三部分:IB结构域(从第26个氨基酸到第100个氨基酸)、KAZAL结构域(从第97个氨基酸到第138个氨基酸)和IG_like(从第154个氨基酸到第233个氨基酸)。青虾IAGBP基因组序列和IAG基因组一样也存在两个拷贝,这两个拷贝均由4个外显子和3个内含子组成。两者的区别在于,第1内含子的长度上有所不同。具体构成如下,IAGBP基因组序列Ⅰ全长4055bp(GenBank:KJ831648),具体为:外显子1(98bp)、内含子1(2084bp)、外显子2(323bp)、内含子2(625bp)、外显子3(144bp)、内含子3(587bp)、外显子4(194bp);IABP基因组序列Ⅱ全长3678bp(GenBank:KJ831647),此序列第1内含子为1707bp,其它的内含子和外显子长度与IAGBP基因组序列Ⅰ相同。IAGBP基因在检测的组织中都有表达。在精巢的表达量最高,其次是肌肉和肝胰腺,表达量最少的组织是眼柄。IAGBP基因在胚胎期表达最低,出膜后表达量逐渐升高,在变态后保持较高的表达量,在成体的表达量最高。2.青虾IAG和IAGBP基因相互调控关系的研究本文采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)和荧光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)技术,在转录水平上研究了上述两个基因的相互调控关系。沉默IAGBP基因,IAGBP和IAG基因的表达量与对照组相比分别下降到21.4%和43.5%(P<0.01)。沉默IAG基因,IAG基因的表达量下降到对照组的11.6%(P<0.01),而在精巢、肌肉、促雄腺和肝胰腺等组织,IAGBP基因的表达量分别下降到对照组的52.4%(P<0.01)、58.4%(P<0.01)、55.3%(P<0.01)和59.7%(P<0.01);在眼柄、脑、心脏和神经索组织中,IAGBP基因的表达量没有明显变化。结果表明,青虾IAGBP和IAG基因存在相互的正调控关系。3.GIH,MIH和CHH基因对IAG基因调控作用的研究本文采用RNAi和qRT-PCR技术,研究了GIH,MIH和CHH基因对IAG基因的调控作用,同时运用基因组步移技术克隆了GIH,MIH和CHH基因组序列。基因组步移的结果显示,GIH,MIH和CHH基因组序列均由3个外显子和2个内含子组成。具体而言,GIH的基因组序列包括:外显子1(36bp)、内含子1(511bp)、外显子2(189bp)、内含子2(1507bp)、外显子3(114bp);MIH的基因组序列包括:外显子1(36bp)、内含子1(752bp)、外显子2(183bp)、内含子2(649bp)、外显子3(114bp);CHH的基因组序列包括:外显子1(18bp)、内含子1(1524bp)、外显子2(285bp)、内含子2(729bp)、外显子3(105bp)。在这三个多肽序列中GIH和MIH拥有相同的内含子插入位点:内含子1插入在Gln12和Lys13(GIH)/Arg13(MIH)之间,内含子2插入在成熟多肽的Lys41(GIH)/Arg41(MIH)和Lys42之间。而CHH的内含子插入位点则与它们不同,内含子1的插入位点在Val6和Met7之间,内含子2的插入位点在成熟多肽的Arg40和Glu41之间。本文第一次在DNA水平提供了CHH家族神经激素基因的分类依据。本文在转录水平研究了CHH家族神经激素基因对IAG基因的调控作用。实验设置3个眼柄处理组:未剪除组(对照组)、单侧眼柄剪除组和双侧眼柄剪除组;3个实验组:分别干扰GIH,MIH和CHH基因。沉默GIH,MIH和CHH基因发现,GIH,MIH和CHH基因的转录水平分别下降到对照组的13.5%(P<0.01)、19.4%(P<0.01)和22.5%(P<0.01)。本文进一步将3个干扰组中IAG基因的表达量与对照组、单侧眼柄剪除组和双侧眼柄剪除组做了对照。IAG基因的表达量与对照组相比分别上升了452.7%(P<0.01)(单侧眼柄剪除组)、660.2%(P<0.001)(GIH干扰组)、472.9%(P<0.01)(MIH干扰组)、112.4%(P>0.05)(CHH干扰组)、1049.1%(P<0.001)(双侧眼柄剪除组)。结果表明,GIH和MIH基因负调控IAG基因的表达。4.青虾IAG基因组序列中与生长性状相关的SNP位点筛选本文应用限制性酶切长度片段多态性(Restriction fragment length polymorphism-PCR,RFLP-PCR)技术在青虾IAG基因的内含子区域进行了与生长性状相关的SNP位点筛选。结果显示,在IAG基因组第一内含子和第二内含子中发现了4个SNP位点:509G>T、529G>T和590A>T位于内含子1,2226A>G位于内含子2。4个SNP位点的多态信息含量(PIC)为:根据多态信息含量(PIC)分类标准(PIC≤0.25,低度多态性;0.25<PIC<0.50,中度多态性;PIC≥0.50,高度多态性),位点529G>T和590A>T,属于高度多态性位点;位点2226A>G,属于中度多态性位点;位点509G>T,属于低度多态性位点。4个SNP位点与生长性状(体长,BL;体重,BW)的相关性分析表明,在位点2226A>G,GG基因型的个体比AA型和GA型个体拥有更长的体节(P<0.01)和更重的体重(P<0.05)。本文首次克隆了IAGBP基因的cDNA序列;IAG,IAGBP,CHH,GIH和MIH基因组序列;首次研究了IAG和IAGBP基因的相互调控关系;首次阐述了CHH家族神经激素基因对IAG基因的调控作用;首次在IAG基因组中筛选到与生长性状相关的SNP位点。本研究结果不仅有助于阐明青虾性别决定和调控机制,为青虾性别控制育种提供指导,而且可为甲壳动物其它物种性别决定机制的研究提供参考。