次声波是由物体机械振动产生的声波,频率为0.0001~20 Hz,是环境和工业噪声的重要组成部分,在自然界与人工环境中广泛存在。人体器官的固有频率(如内脏为4~6 Hz,头部为8~12 Hz)恰好在次声波的频率范围内,因此当人处在次声环境时,次声波会引起人体器官的强烈共振,对机体造成功能性甚至器质性的损伤。次声引起的各脏器结构与功能损伤中,最为首要和严重的是脑的损害,长期次声暴露可引起倦怠、精力不集中、头晕、恶心等认知能力下降和神经精神症状。因此,对次声生物学效应进行深入研究,尤其是要重视其对脑的损伤研究,明确次声损伤的具体机理,是对次声损害进行防护和治疗的基础和前提。以往对次声引起神经系统损害的研究多集中在对神经元胞体本身的研究,而神经元轴突在次声中的变化长期被忽视。事实上,胞体与轴突共同组成了神经系统的结构功能基本单元,轴突在对外伤,多种代谢、中毒和炎症疾病的反应中其变化较胞体本身更为早期和敏感。本实验中我们采取体外培养海马神经元模型,观察次声暴露后轴突的变化,探讨次声暴露后神经元轴突变性与胞体凋亡之间的关系,并通过药物干扰的手段,从Ca2+相关通路、泛素-蛋白酶(ubiquitin-proteasome system, UPS)通路和RhoA/ROCK信号通路三方面探究次声暴露引起的轴突变性的可能机制,旨在为次声防护提供新思路。此外,我们还采用Ca2+拮抗剂/神经保护药物人参皂甙Rd对次声引起的轴突变性进行干预,发现Rd能够显著地保护轴突,延缓变性的发生,同时保护神经元胞体。主要研究结果如下:(1)成功建立了低密度原代培养海马神经元模型,为观察次声暴露后单个轴突与其所属神经元的变化奠定了基础。(2)16Hz/130dB次声暴露1h后,观察0,4,8,12,24 h各时间点的轴突变化:anti-βIII-tubulin免疫细胞化学染色发现,轴突于次声暴露后4~8h逐渐出现了局部肿胀和串珠形成等早期变性表现;至次声暴露后12~24h,轴突几乎完全退变崩解,严重变性。同时使用轴突运输障碍的标志物anti-APP免疫荧光染色,发现次声暴露后4h,APP即开始在轴突运输受损部位堆积,从轴浆运输的角度证实了次声确能引起轴突变性发生。稳定聚合态微管蛋白Glu-tubulin免疫荧光染色发现,次声暴露后4h,Glu-tubulin信号即开始减弱并发生局灶性缺失,提示次声暴露后微管解聚增加。(3)应用TUNEL法、Hoechst细胞核染色及凋亡标志物cleaved caspase-3的Western blot方法同时检测次声暴露后的细胞凋亡情况,探讨次声暴露引起的细胞凋亡与轴突变性之间的关系,发现虽暴露后各时间点凋亡神经元数量均较未受次声暴露对照组有所增加,但是在次声暴露后4h开始凋亡神经元数量远小于轴突出现串珠等变性表现的神经元。Western blot实验也发现Glu-tubulin蛋白表达在次声暴露后即逐渐开始降低,而cleaved caspase-3的表达水平则在次声暴露后8~24h才发生较显著的增高。提示轴突对次声暴露比神经元胞体更为敏感,反应更为迅速,且次声暴露引起的轴突变性可能并不依赖于神经元凋亡。(4)应用EGTA,ALLN,Fasudil和MG132分别对Ca2+相关通路、UPS通路和RhoA/ROCK信号通路进行药物干预,免疫细胞化学染色和Westernblot结果显示EGTA、ALLN、Fasudil能够显著延缓次声暴露后的轴突变性,同时发挥一定的胞体保护作用;MG132对次声暴露后轴突变性的保护作用较为狭窄和局限。(5)免疫细胞化学染色和TUNEL分析结果显示,Rd预防性应用能够显著延缓次声引起的轴突变性,同时可保护胞体免于凋亡。结论:本研究首次关注了次声暴露后体外培养神经元轴突的变化,发现次声暴露能够引起轴突变性,且轴突变性的发生早于胞体凋亡,提示轴突同样是次声作用的靶点,且对次声的反应比胞体更为敏感。Ca2+相关通路可能在次声引起轴突变性中起着重要作用。因此对次声引起的轴突变性进行干预可能成为次声防护的有效辅助措施。Rd能够对次声引起的轴突变性发挥显著的延缓作用,有效保护轴突及胞体,可能成为次声防护与治疗的有效药物。