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前言目前对青光眼的治疗方法主要是通过药物或手术降低眼压,然而单纯降低眼压并不足以防止青光眼引起的视神经进行性损害,其他病理机制也很可能导致视网膜神经节细胞(RGCs)和视神经的损伤。所有可能造成RGCs凋亡的因素如谷氨酸毒性、营养因子中断、血管异常、胶质细胞活化及一氧化氮的毒性等,均可能与青光眼的病变有关。但是各种毒性因素最终导致RGCs凋亡的过程中通过了何种信号通路,凋亡基因如何调控等等的机制并不清楚。因此,从不同水平弄清楚各种信号通路及凋亡基因的调控对此类疾病的治疗将起到至关重要的作用。以往视网膜缺血一再灌注损伤模型是公认的研究视网膜损伤和RGCs凋亡的重要工具。而关于损伤和凋亡在慢性高眼压模型的研究相对较少。在慢性高眼压过程中,随着高眼压时间持续,视网膜神经纤维层逐渐变薄,RGCs凋亡增加。这些病理变化同时伴随着各种信号转导通路激活或抑制及各种凋亡相关基因的表达异常。因此对各种信号转导通路以及对各种凋亡相关基因的调控可作为评价视神经保护剂的可靠指标之一。信号转导通路及凋亡相关基因是当今分子生物学的研究热点之一。目前的研究发现与细胞生长,增殖,凋亡有关的转录因子及信号通路有PI-3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)/AKT通路;NF-κB(核转录因子)通路及细胞凋亡相关基因Caspase-9(半胱氨酸蛋白酶)的调控等。PI-3K又称磷脂酰肌醇-3-激酶,是一类特异的催化磷脂酰肌醇物质的激酶.近10几年研究发现PI-3K是一种与细胞转导有关的酯类第二信使。有研究认为:PI-3K及其下游分子AKT参与了NF-κB活性的调节;而且,PI-3K-AKT通路对细胞存活的调节可通过抑制促凋亡分子的活化,如Caspase-9等。NF-κB又称核转录因子,是一种广泛存在于体内各种细胞的核转导因子。作为一种多向性调节蛋白,NF-κB可以介导细胞存活信号,防止细胞凋亡,各种研究表明、细胞抗凋亡作用的启动信号仍然是各种生存因子通过受体激酶的介导,激发以NF-κB为中心的正向级放大的信号转导通路,促使NF-κB调控的抗凋亡基因如Bcl-2家族成员等的激活及Caspase-9等的凋亡。Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族,根据Caspase一级结构及其N端原结构域的长短,可将起分为两大类(1)启动子Caspase主要起激发和调节凋亡的始动作用.包括Caspase-8,9,10等。(2)效应子:主要对底物蛋白质进行酶解作用,直接导致凋亡,包括Caspase-3,6,7等。综上所述,在复杂的信号转导通路中,我们知道存在这样的调控关系,PI-3K对NF-κB有上调作用,PI-3K对Caspase-9有下调作用;NF-κB对Caspase-9有下调作用。氨基胍(AG)是目前发现的一种安全有效的诱导型一氧化氮合酶(INOS)抑制剂,广泛的应用于心肌缺血,脑缺氧的研究中,在青光眼的研究中报道较少,Neufield等报到在大鼠慢性高眼压模型中,AG能起到对视神经的保护作用,但AG对慢性高眼压视网膜保护作用的机制都不是很清楚.这种保护作用是否通过各种信号通路介导抗凋亡作用,尚有待进一步了解。材料及方法本实验包括三部分:第一部分:AG对大鼠慢性高眼压视网膜Caspase-9表达的影响。分别应用免疫组织化学染色方法、RT-PCR方法及Western blotting方法检测凋亡相关基因Caspase-9在大鼠正常视网膜(A组),慢性高眼压3天、7天、14天、21天、28天视网膜(B组)及应用AG后的慢性高眼压3天、7天、14天、21天、28天视网膜(c组)的表达变化情况。第二部分:AG对大鼠慢性高眼压视网膜NF-κB表达的影响。分别应用免疫组织化学染色方法及Western blotting方法检测凋亡相关基因NF-κB在大鼠正常视网膜(A组),慢性高眼压3天、7天、14天、21天、28天视网膜(B组)及应用AG后的慢性高眼压3天、7天、14天、21天、28天视网膜(C组)的表达变化情况。第三部分:AG对大鼠慢性高眼压视网膜PI-3K表达的影响。分别应用免疫组织化学染色方法、RT-PCR方法及Western blotting方法检测凋亡相关基因PI-3K在大鼠正常视网膜(A组),慢性高眼压3天、7天、14天、21天、28天视网膜(B组)及应用AG后的慢性高眼压3天、7天、14天、21天、28天视网膜(C组)的表达变化情况。结果一、AG对大鼠慢性高眼压视网膜Caspase-9表达的影响(一)A组(对照组):正常大鼠视网膜分为10层(与人视网膜相似),免疫组化显示Caspase-9表达仅限于RGCs层,0-1/HP。RT-PCR及Western blotting检测仅有微量表达。(二)B组:造模后21天、28天点模型眼RGCs及神经纤维层厚度较对照组变薄(P＜0.05)。免疫组化方法Caspase-9表达主要位于RGCs层及内核层细胞核,除第3天外,其余各时间点RGCs层及内核细胞层细胞核阳性数及着染深度均增加(P＜0.05或0.01),至7天、14天达到顶峰。RT-PCR及Western blotting显示出第3天外,其余各时间点Caspase-9表达均较A组增强(P＜0.05或0.01)。(三)C组:应用AG后21天、28天模型眼RGCs及神经纤维层厚度较对照组变薄,但较B组厚(P＜0.05)。免疫组化检查RGCs层及内核层细胞Caspase-9阳性表达强度介于A、C两组之间(P＜0.05)。RT-PCR及Western blotting显示Caspase-9表达趋势与B组相似,但其峰值出现时间也在7到14天,峰值小于B组(P＜0.05)。二、AG对大鼠慢性高眼压视网膜NF-κB信号转导途径的影响(一)A组:组织学检查与实验—A组相似,免疫组化检查该组大鼠视网膜组织在RGCs层及内核层有微量NF-κB蛋白阳性表达。Western blotting几乎无明显表达。(二)B组:造模后21,28天模型眼RGCs及神经纤维层厚度较A组变薄(P＜0.05)。免疫组化染色显示NF-κB阳性细胞7天、1 4天时达到峰值(P＜0.05)。Western blotting显示在同时间点上NF-κB表达均较A组增强(P＜0.05)。(三)C组:应用AG后21,28天模型眼RGCs及神经纤维层厚度较A组变薄,但较B组厚(P＜0.05)。免疫组化显示NF-κB阳性表达时程与B组相似,但强度高于B组(P＜0.05)。RT-PCR及Western blotting显示该组各时间点NF-κBmRNA及蛋白阳性表达强度大于B组(P＜0.05)。三、AG对大鼠慢性高眼压视网膜PI-3K信号转导途径的影响(一)A组:组织学检查与实验—A组相似,免疫组化检查该组大鼠视网膜组织在RGCs层有微量PI-3K蛋白阳性表达。RT-PCR及Western blotting亦显示微弱阳性表达。(二)B组:造模后21,28天模型眼RGCs及神经纤维层厚度较A组变薄(P＜0.05)。免疫组化染色显示RGCs层PI-3K蛋白阳性细胞表达随高眼压时间推移逐渐增强(P＜0.05或0.01),建模后第7天即达峰值,然后缓慢减弱。RT—PcR及Western blotting亦显示PI-3K阳性表达时程变化与免疫组化结果相符合。(三)C组:应用AG后21天,28天模型眼RGCs及神经纤维层厚度较A组变薄,但较B组厚(P＜0.05)。免疫组化、RT-PCR及Western blotting结果同样表明在相同时间点该组大鼠视网膜PI-3K阳性表达强度明显高于B组(P＜0.05或0.01),而且在建模后第7天即出现峰值。结论一、在慢性高眼压状态下,某些促凋亡信号(如Caspase-9)和抑制凋亡信号(如NF-κB、PI-3K)可能几乎同时发生作用。二、在慢性高眼压状态下,AG通过下调凋亡相关基因Caspase-9的表达对视网膜起保护作用。三、在慢性高眼压状态下,AG通过上调核因子NF-κB的表达对视网膜起保护作用。四、在慢性高眼压状态下,AG通过上调磷脂酰肌醇-3-激酶PI-3K的表达对视网膜起保护作用。总之,信号转导途径纷繁复杂,许多机制尚不十分清楚。本研究表明,AG有可能在信号转导途径的多点位上起作用,发挥其对慢性高眼压视网膜的保护作用。但详细机制尚需要在今后的工作中进一步探讨研究。