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目的:从“胆碱能过活化致抑郁”学说入手,探讨电针对慢性不可预测温和应激(以下简称CUMS)模型大鼠行为学及前额叶胆碱能因子的影响,并阐明电针可能通过抑制胆碱能过活化,改善CUMS模型大鼠抑郁症状的作用机理。方法:第一部分电针调节ACh代谢改善CUMS模型大鼠的抑郁症状和突触损伤的研究1.动物与分组将54只SPF级雄性健康SD大鼠随机分为6组:正常组、模型组、电针组、东莨菪碱组(阳性药物组)、毒扁豆碱组(胆碱酯酶抑制剂组)、电针+毒扁豆碱组。2.造模方法除正常组外,其余各组均采用CUMS联合孤养方法构建抑郁大鼠模型,10种刺激方法:禁食(24 h)、禁水(24 h)、冰水游泳(4℃,5 min)、潮湿垫料(24 h)、昼夜颠倒(24 h)、行为限制(4h)、45°倾笼(24 h)、夹尾(2 min)、噪音(85Db,3h)、整夜频闪(12h),每日1种,持续42天。3.干预方法造模第29天开始,电针组大鼠进行电针“疏肝调神”针灸方案基础穴组(百会、印堂、合谷、太冲)治疗,2/100Hz,1～1.2mA,持续20min,每日1次;东莨菪碱组大鼠进行东莨菪碱腹腔给药(25μg/kg),每48小时1次;毒扁豆碱组大鼠进行毒扁豆碱腹腔给药(0.5 mg/kg),每日1次;电针+毒扁豆碱组进行电针和毒扁豆碱干预,方法分别同电针组与毒扁豆碱组,药物干预后再进行电针治疗。电针或药物干预持续14天。4.检测指标(1)体重及行为学:体质量、蔗糖偏好率、不动时间、延迟进食时间;(2)ELISA法检测胆碱能相关因子:血清和前额叶ACh,前额叶乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰转移酶(ChAT)含量;(3)高尔基染色法观察前额叶第V层锥体神经元顶树突棘形态和数量(树突棘密度);(4)Western Blot法检测前额叶突触相关蛋白表达:PSD95、Synapsin Ⅰ、GluR1和GluR2;(5)Western Blot法检测前额叶M1AChR蛋白表达。第二部分电针拮抗M1AChRs改善CUMS模型大鼠抑郁症状和突触损伤的研究1.动物与分组将54只SPF级雄性健康SD大鼠随机分为6组:正常组、模型组、电针组、东莨菪碱组(M1AChR拮抗剂组)、槟榔碱组(M1AChR激活剂组)、电针+槟榔碱组。2.造模方法除正常组外,其余各组均采用CUMS联合孤养方法构建抑郁大鼠模型,造模方法同“第一部分”。3.干预方法造模第29天开始,电针组大鼠进行电针干预,东莨菪碱组大鼠进行腹腔注射东莨菪碱,方法同“第一部分”;槟榔碱组大鼠进行腹腔注射槟榔碱(2mg/kg),每日1次;电针+槟榔碱组进行电针和槟榔碱干预,方法分别同电针组与槟榔碱组,药物干预后再进行电针治疗。电针或药物干预持续14天。4.检测指标:(1)体重及行为学:体质量、蔗糖偏好率、延迟进食时间、水平活动、垂直活动及理毛次数;(2)高尔基染色法观察前额叶第V层锥体神经元顶树突棘形态和数量(树突棘密度)以及树突复杂性(总长度和分支数);(3)Western Blot法检测前额叶BDNF/mTORC1信号通路蛋白和突触相关蛋白PSD95、Synapsin Ⅰ、GluR1 和 GluR2 的相对表达量;(4)Western Blot法检测前额叶M1AChR相对表达量。结果:第一部分电针调节ACh代谢改善CUMS模型大鼠的抑郁症状和突触损伤的研究1.电针对抑郁模型大鼠的行为学的影响造模前,正常组与模型组大鼠的体质量和蔗糖偏好率均无显著性差异;在造模第7、14、21和28天时,模型组大鼠体质量和蔗糖偏好率均较正常组显著降低(P<0.05),说明抑郁大鼠模型构建成功。在干预前,电针组、东莨菪碱组、毒扁豆碱组和电针+毒扁豆碱组大鼠的体质量和蔗糖偏好率与模型组比较均无显著性差异(P>0.05),说明干预前基线一致。干预第7天,与正常组比较,模型组大鼠体质量和蔗糖偏好率均有显著性降低(P<0.001);而电针组和东莨菪碱组大鼠平均体质量和蔗糖偏好率均显著增加(P<0.05),两组大鼠平均体质量与蔗糖偏好率比较无显著性差异(P>0.05),毒扁豆碱组大鼠体质量与模型组比较未见显著性差异(P>0.05),而蔗糖偏好率较模型组显著降低(P<0.01);与毒扁豆碱组比较,电针组和电针+毒扁豆碱组大鼠体质量和蔗糖偏好率均显著增加(P<0.05)。干预第14天,与正常组比较,模型组大鼠体质量、蔗糖偏好率均显著性降低(P<0.001),不动时间、延迟进食时间均显著延长(P<0.001);与模型组比较,电针组和东莨菪碱组大鼠体质量、蔗糖偏好率均显著增加,不动时间、延迟进食时间均显著缩短(P<0.05),两组比较无显著性差异(P>0.05),说明电针表现出与东莨菪碱同样具有抗抑郁效应;毒扁豆碱组大鼠体质量和蔗糖偏好率较模型组均有显著性降低,不动时间和延迟进食时间均显著延长(P<0.05);与毒扁豆碱组比较,电针组和电针+毒扁豆碱组大鼠体质量和蔗糖偏好率均有显著性增加,而不动时间和延迟进食时间均显著缩短(P<0.05),说明毒扁豆碱可诱导加重模型大鼠抑郁症状,而电针可一定程度上改善毒扁豆碱所致的抑郁症状。2.电针对抑郁模型大鼠的前额叶胆碱能ACh代谢的影响模型组大鼠前额叶和血清内ACh含量均较正常组显著升高(P<0.05),前额叶AChE含量有显著性降低(P<0.05),前额叶ChAT含量有显著性升高(P<0.05);而电针组大鼠前额叶和血清内ACh含量显著性降低(P<0.05),前额叶AChE含量显著升高(P<0.05),前额叶ChAT含量显著降低(P<0.05);毒扁豆碱组大鼠较模型组前额叶和血清内ACh含量均显著升高(P<0.05),而前额叶AChE和ChAT含量均未见显著性差异(P>0.05);与毒扁豆碱组比较,电针组和电针+毒扁豆碱组大鼠前额叶和血清内平均ACh含量均显著性降低(P<0.05),前额叶AChE显著升高,前额叶ChAT显著降低(P<0.05)。3.电针对毒扁豆碱致胆碱能过活化抑郁模型大鼠的前额叶树突棘密度的影响模型组大鼠前额叶树突棘总密度、成熟型和不成熟型树突棘密度均较正常组显著减少(P<0.05);而毒扁豆碱组大鼠前额叶树突棘总密度、成熟型和不成熟型树突棘密度均较模型组显著减少(P<0.05);与毒扁豆碱组比较,电针+毒扁豆碱组大鼠前额叶树突棘总密度、成熟型和不成熟型树突棘密度显著增加(P<0.05)。4.电针对毒扁豆碱致胆碱能过活化抑郁模型大鼠的前额叶突触相关蛋白表达的影响模型组大鼠前额叶BDNF、GluR1、GluR2、PSD95和Synapsin I蛋白相对表达量均较正常组显著减少(P<0.001);与模型组比较,毒扁豆碱组大鼠前额叶BDNF、GluR1、GluR2、PSD95和Synapsin Ⅰ蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);与毒扁豆碱组比较,电针+毒扁豆碱组大鼠前额叶BDNF、GluR1、GluR2、PSD95和SynapsinⅠ蛋白相对表达量均显著增加(P<0.01)。5.电针对毒扁豆碱致胆碱能过活化抑郁模型大鼠前额叶M1AChR表达的影响各组间前额叶M1AChR相对表达量比较有显著性差异(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达量均显著增加(P<0.001);与模型组比较,毒扁豆碱组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达量显著增加(P<0.001);与毒扁豆碱组比较,电针+毒扁豆碱组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达量显著减少(P<0.001)。第二部分电针拮抗M1 AChRs改善CUMS模型大鼠抑郁症状和突触损伤的研究1.电针对M1AChRs激活胆碱能过活化抑郁模型大鼠的体质量和行为学的影响干预前(造模第29天),与正常组比较,模型组大鼠体质量和蔗糖偏好率显著降低(P<0.01);与模型组比较,电针组、东莨菪碱组、槟榔碱组和电针+槟榔碱组大鼠的体质量和蔗糖偏好率均无显著性差异(P>0.05)。说明CUMS联合孤养抑郁大鼠模型构建成功,干预前各组间基线一致,具有可比性。干预后,与正常组比较,模型组大鼠体质量和蔗糖偏好率均显著降低,延迟进食时间显著延长,水平活动、垂直活动与理毛次数均显著减少(P<0.05);与模型组比较,电针组和东莨菪碱组大鼠体质量和蔗糖偏好率均显著增加,延迟进食时间显著缩短,水平活动、垂直活动与理毛次数均显著增加(P<0.05),两组比较无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,槟榔碱组大鼠体质量和蔗糖偏好率有显著性降低,延迟进食时间显著延长,水平活动显著减少(P<0.05),垂直活动和理毛次数无显著性差异(P>0.05);而电针组和电针+槟榔碱组大鼠体质量和蔗糖偏好率均较槟榔碱组显著增加,延迟进食时间显著缩短,水平活动、垂直活动和理毛次数均显著增加(P<0.05)。说明槟榔碱在一定程度上诱导模型大鼠抑郁症状,而电针可改善槟榔碱所致受体激活导致的抑郁症状。2.电针对M1AChRs激活胆碱能过活化抑郁模型大鼠前额叶树突棘密度与复杂性的影响与正常组比较,模型组大鼠树突棘总密度、成熟型与不成熟型树突棘密度显著减少(P<0.001),树突棘前体密度未见显著性差异(P>0.05),顶树突总长度显著减少(P<0.01),直径在10 μm-190 μm的顶树突分支数显著减少(P<0.05)。与模型组比较,电针组和东莨菪碱组大鼠树突棘总密度均显著增加(P<0.001),电针组成熟型树突棘密度较模型组未见显著性差异(P>0.05),而不成熟型与树突棘前体密度均较模型组显著增加(P<0.01),东莨菪碱组大鼠平均成熟型和不成熟型树突棘密度均显著增加(P<0.001),而树突棘前体密度未见显著性差异(P>0.05);电针组和东莨菪碱组大鼠顶树突总长度均显著增加(P<0.05),电针组直径在10μm-110μm顶树突分支数较模型组显著增加(P<0.05),东莨菪碱组直径在100 μm-190 μm顶树突分支数较模型组显著增加(P<0.05)。电针组与东莨菪碱组两组比较,树突棘总密度较东莨菪碱组有显著性减少(P<0.05),直径在10μm-90μm顶树突分支数较东莨菪碱组显著增加(P<0.05),在130 μm-190μm显著减少(P<0.05);而成熟型、不成熟型、树突棘前体密度、顶树突总长度两组比较均未见显著性差异(P>0.05)。槟榔碱组大鼠树突棘总密度、成熟型与不成熟型树突棘密度较模型组有显著性减少(P<0.001),而树突棘前体密度、顶树突总长度未见显著性差异(P>0.05)。与槟榔碱组比较,电针组大鼠树突棘总密度、成熟型与不成熟型树突棘密度、树突棘前体密度、顶树突总长度均显著增加(P<0.01),直径在10μm-30μm和50 μm-170 μm顶树突分支数较槟榔碱显著增加(P<0.05);与槟榔碱组比较,电针+槟榔碱组树突棘总密度、成熟型与不成熟型树突棘密度、顶树突总长度均显著增加(P<0.001),直径在110μm-170μm顶树突分支数显著增加(P<0.05),而树突棘前体密度未见显著性差异(P>0.05)。3.电针对M1AChRs激活胆碱能过活化抑郁模型大鼠前额叶BDNF/mTORC1信号通路与突触相关蛋白的影响与正常组比较,模型组大鼠前额叶BDNF、mTORC1、p-mTORC1、GluR1、GluR2、PSD95和Synapsin Ⅰ蛋白相对表达量均有显著性减少(P<0.05)。与模型组比较,电针组和东莨菪碱组大鼠前额叶BDNF、mTORC1、p-mTORC1、GluR1、GluR2、PSD95和Synapsin Ⅰ蛋白相对表达量均显著增加(P<0.05),两组比较均能未见显著性差异(P>0.05);槟榔碱组大鼠前额叶BDNF、mTORC1、p-mTORC1、GluRl、GluR2、PSD95和Synapsin Ⅰ蛋白相对表达量显著减少(P<0.05)。与槟榔碱组比较,电针组与电针+槟榔碱组大鼠前额叶 BDNF、mTORCl、p-mTORC1、GluR1、GluR2、PSD95和Synapsin Ⅰ蛋白相对表达量均显著增加(P<0.05)。4.电针对M1AChRs激活胆碱能过活化抑郁模型大鼠前额叶M1AChR表达的影响与正常组比较,模型组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达量显著增加(P<0.05);与模型组比较,电针组和东莨菪碱组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达有显著性减少(P<0.05),两组比较无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,槟榔碱组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达量显著增加(P<0.001);与槟榔碱组比较,电针组和电针+槟榔碱组大鼠前额叶M1AChR蛋白相对表达量均显著减少(P<0.01)。结论:1.电针可调节胆碱能因子的表达,提高前额叶AChE水平,抑制ACh的堆积,从而促进CUMS联合孤养模型大鼠前额叶突触损伤的修复(突触形态、数量及功能),改善模型大鼠的抑郁症状。2.电针可通过降低M1AChR蛋白表达,增强突触可塑性,改善模型大鼠的抑郁症状,其机制可能与抑制胆碱能过活化,激活BDNF/mTORC1信号通路有关。