人巨细胞病毒(HCMV)在自然界分布广泛。妊娠期HCMV活动性感染可以通过胎盘垂直传播，导致宫内传播，引发流产、死胎、畸形及胎儿生长受限(IUGR)等不良妊娠结局；胎儿先天性HCMV感染，约有15％新生儿在出生后可发展为一种或多种神经系统异常：如智力发育迟缓、学习无能、听力或视力受损，通常出现于出生后1～2年内。先天性CMV感染是引起孩子听力损害的重要原因。大约有1‰婴儿在出生时出现CMV感染症状，这些症状有：肝脾肿大、黄疸、颅内钙化和异常皮疹等。这些婴儿中约20％死亡，幸存者中有90％并有严重的神经系统发育缺陷如智力低下、听力缺陷等远期后遗症，严重影响人口出生质量。 目前国外有学者运用定量PCR技术检测母血、羊水等的HCMVDNA量来预测胎儿感染情况，但结论及相关标准尚不确定。在治疗方面，现阶段国际上通用的更昔洛韦等抗HCMV药物易引起致畸作用而限制了妊娠期HCMV感染的用药。国内学者通过多年的实验及临床研究发现中药金叶败毒制剂具有抗病毒、提高机体免疫力的作用，可有效拮抗HCMV感染，表现为与更昔洛韦相当的抗病毒作用，且无明显的毒副作用。作为中药复合制剂，金叶败毒制剂作用靶点众多，机理复杂，其确切的分子作用机制尚待进一步阐明。 基于上述研究现状，本课题采用体外实验方法，探讨中药金叶败毒制剂体外抗病毒效应及与HCMV感染细胞的病变及增殖活性的相关性，并从病毒蛋白激酶pul97基因表达、受染细胞内CyclinD1、CDK4、P16蛋白表达及对细胞周期和凋亡的影响等方面研究中医药金叶败毒制剂抗HCMV感染的作用机理，以对妊娠期HCMV感染的致病机制及其治疗有所提示。 第一部分中药金叶败毒制剂体外抗病毒效应的实验研究 目的:研究中药金叶败毒制剂抗HCMVAD169感染的效应。 方法:采用细胞病变(CPE)抑制法观察不同浓度GCV和金叶败毒制剂对HCMVAD169毒株的抑制作用；应用MTT法检测细胞的损伤程度，并利用A值评价两种药物不同浓度下的抗HCMV病毒效应。 结果:金叶败毒制剂的半数中毒浓度(TD50)为16mg/ml，半数有效浓度(IC50)为4mg/ml，治疗指数(TI)为4；GCV的TD50为100μg/ml，IC50为25μg/ml，TI为4。金叶败毒制剂具有抗病毒作用，且随浓度的增高其作用也增强，其抗HCMV作用与GCV相当，差异无显著性。 结论:中药金叶败毒制剂在4mg/ml浓度时对病毒的增殖具有较强的抑制作用，是理想的抗HCMV中药。 第二部分中药金叶败毒制剂抑制人巨细胞病毒蛋白激酶pul97的实验研究 目的:研究中药金叶败毒制剂对人巨细胞病毒(HCMV)蛋白激酶pul97的抑制作用，探讨其治疗HCMV感染的分子机制。 方法:利用倒置显微镜观察中药金叶败毒制剂和更昔洛韦(GCV)对HCMV感染人胚肺成纤维细胞(HEL)细胞病变(CPE)的影响，应用MTT法观察两种药物对感染细胞增殖活性的影响，并采用半定量RT-PCR方法，检测两种药物干预后感染细胞HCMVpul97mRNA表达水平。 结果:金叶败毒制剂能明显延缓感染细胞的细胞病变，在HCMV感染72h后可明显增强感染细胞的增殖活性，其对HCMVpul97mRNA的抑制作用在HCMV感染12h后就已出现，感染24～48h抑制作用达到高峰。 结论:金叶败毒制剂可能通过抑制HCMV蛋白激酶pul97基因的表达而抑制HCMV的表达和复制，从而延缓感染细胞的细胞病变，促进感染细胞的增殖而达到抗病毒作用。 第三部分中药金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染细胞CyclinD1、CDK4、P16蛋白表达调控的实验研究 目的:研究中药金叶败毒制剂干预后HCMV感染细胞CyclinD1、CDK4、P16的表达调节，探讨中药金叶败毒制剂抗HCMV感染的作用机制。 方法:用HCMVAD169感染人胚肺成纤维细胞，应用半定量RT-PCR方法，检测中药金叶败毒制剂和更昔洛韦(GCV)干预后感染细胞cyclinD1mRNA及细胞周期素依赖激酶4(CDK4)mRNA的表达水平。同时应用免疫组织化学的方法分别检测两种药物干预后感染细胞cyclinD1、细胞周期素依赖激酶4(CDK4)及P16蛋白的表达水平。 结果:HCMV感染后，宿主细胞周期调控蛋白cyclinD1和CDK4的表达水平逐渐降低；而金叶败毒制剂干预后，在HCMV感染12h后就出现两种蛋白的表达增强，在感染48～96h后作用达高峰。在HCMV感染24～48h内，P16蛋白的表达较弱，在感染72～96h后P16蛋白表达达高峰；而金叶败毒制剂干预后，在感染12～24h未见P16蛋白表达，感染48～72h后P16蛋白的表达仍较弱。 结论:金叶败毒制剂可能通过促进HCMV感染细胞cyclinD1及CDK4的表达，抑制P16蛋白的表达，促进宿主细胞增殖而发挥抗病毒作用。 第四部分中药金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染宿主细胞周期和凋亡的影响的实验研究 目的:探讨中药金叶败毒制剂对人巨细胞病毒(HCMV)感染宿主细胞周期和凋亡的影响。 方法:用HCMVAD169感染人胚肺成纤维细胞，分别用金叶败毒制剂和更昔洛韦干预后，采用流式细胞技术对HCMV感染及药物干预后宿主细胞进行细胞周期和凋亡分析。 结果:HCMV感染48h后宿主细胞的G0/G1期细胞明显减少，S及G2/M期细胞明显增多。而经金叶败毒制剂干预后，在HCMV感染48h后宿主细胞的G0/G1期细胞增多，S及G2/M期细胞减少。在HCMV感染48h后，凋亡细胞数显著增加，且随感染时间延长，细胞凋亡数逐渐增加；经金叶败毒制剂干预后，对细胞凋亡的抑制作用在感染48h后就出现，且在不同的感染时相，均表现有抑制作用， 结论:HCMV感染是通过诱导宿主细胞G2/M期阻滞，使细胞不能顺利返回G0/G1期而发生凋亡。金叶败毒制剂对HCMV感染所致的细胞周期和凋亡的改变均有明显的抑制作用。