目的:泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin proteasome pathway,UPP)是细胞内一个重要的蛋白质降解调控系统。通过对底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解,参与调控细胞周期、基因转录、免疫反应、肿瘤生长和炎症等众多的细胞进程。该途径也是一个被严格调控的可逆过程,其中去泛素化酶的调节就是一个重要的环节。目前研究证实,细胞内广泛存在多种去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes,DUBs),人类基因组共编码95种去泛素化酶,按结构不同分为5种类型。包括泛素特异性蛋白酶(USPs),泛素羧基末端水解酶(UCHs),Machado-Joseph diseaseprotein domain proteases(MJDs),卵巢肿瘤相关蛋白酶(OTUs),和MPN(+)/JAMM蛋白酶(JAMMs)。　　 USPs为去泛素化酶中成员最多,且结构最具多样性的一类,它主要通过底物蛋白的去泛素化调控蛋白质的半衰期,从而实现其生理功能。目前研究发现,USP与多种疾病有关。如USP2a在前列腺癌中具有抗凋亡作用;UCH-L1基因突变是常染色体显性遗传性帕金森病的致病基因之—;HAUSP(USP7)通过对其底物抑癌基因p53的去泛素化抑制肿瘤细胞的生长。　　 在本课题研究过程中,有文献报道usp46为悬尾试验(TailSuspension Test,TST)和强迫游泳试验(Forced Swimming Test,FST)中调节小鼠不动行为的数量性状基因。研究发现CS小鼠usp46第92号赖氨酸缺失是造成小鼠不动时间短于C57BL/6J小鼠的主要原因,而将野生型usp46转入CS基因小鼠后不动时间明显增加,因此提出LJSP46与行为抑郁有关的假说。　　 本研究通过对usp46基因的克隆,了解usp46在不同组织中的分布情况,建立去泛素化酶活性检测体系,通过检测USP46和第92号赖氨酸去除后USP46(△K92)去泛素酶活性变化等,为抑郁症的病因学研究提供线索,同时为去泛素化酶的分子流行病学研究奠定基础。　　 方法:　　 (1)运用分子克隆的方法克隆大鼠usp46基因。采用TRIzol裂解法提取大鼠脑组织总RNA,运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得usp46。将usp46基因克隆至pGEM-T easy载体,通过蓝白斑筛选实验确定阳性克隆并应用碱裂解法提取质粒,进行双酶切鉴定及测序分析。　　 (2)采用荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)2－△△Ct相对定量方法检测usp46在大鼠骨骼肌、脑组织、心脏、脾脏、肾脏、肝脏、肺脏中的相对表达水平。以GAPDH基因作为参照样本,校正标本之间RNA的质量和逆转录效率的差异进行标准化。以usp46在脑组织中的表达水平作为校准样本比较各组织中usp46表达水平的差异。　　 (3)将usp46基因克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,在大肠杆菌DH.5α中表达,获得带有GST标签的70 KD左右的USP46融合蛋白,同时检测融合蛋白GST-USP46可溶性。　　 (4)构建去泛素化酶活性检测体系,并检测大鼠USP46去泛素化酶活性。USP表达质粒与模型底物(GST-Ub52)表达质粒pGEX-Ub52经IPTG诱导后共表达,研究去泛素化酶的活性。采用定向克隆的方法构建pAC-T7质粒、pAC-T7-usp46质粒。以GST-Ub52做为模型底物,分子量为45 Kda,去泛素化后分子量为36 Kda。以去泛素化酶UBP2作为阳性对照。用GSH-Sepharose-TM Resin纯化蛋白系统纯化GST融合蛋白,进行10％SDS-PAGE电泳检测。　　 (5)采用定点突变法构建usp46突变型(C44S和△K92),用上述方法检测突变型去泛素化酶活性,应用BandScan图像系统分析野生型及突变型活性差异,以阳性对照切断的产物36 Kda蛋白带为标准(亮度定为100)。Usp46突变型C44S为44号半胱氨酸定向突变为丝氨酸,突变型△K92为去除92号赖氨酸。　　 (6)运用分子克隆的方法从人类TE-1食管癌细胞株中克隆usp46基因,构建突变型C44S,并采用去泛素化酶活性检测系统检测人类USP46野生型、突变型去泛素化酶活性。　　 结果:　　 (1)本课题从大鼠脑组织中成功克隆出泛素特异性蛋白酶usp46基因。USP46编码366个氨基酸,推测其相对分子质量为44 Kda。USP46包含高度保守的结构域:Cys、Asp、His区域,符合泛素特异性蛋白酶的特征。　　 (2)Usp46在大鼠骨骼肌、脑组织、心脏、脾脏、肾脏、肝脏、肺脏中的表达水平存在差异。各组织中均可检测出不同程度的usp46表达,其中脾脏和肺脏中的表达量明显高于脑组织中的表达量,分别是脑组织中表达量的2.89和2.64倍;睾丸和肾脏中表达水平与脑组织相近,分别是其1.48和1.12倍;而肝脏、心脏和骨骼肌中表达较少,仅为脑组织中的0.59、0.19、0.06倍。　　 (3)表达出GST-USP46融合蛋白。含重组质粒pGEX-usp46大肠杆菌DH.5α经1mmol IPTG诱导,出现一分子量约70 Kda的新蛋白表达,与GST(分子量为26 gDa)和USP46(分子量约为44 kD)的理论分子量相符,并且为不溶性蛋白。　　 (4)建立去泛素化酶活性检测体系并检测出大鼠USP46具有去泛素化酶活性。GST-Ub52大小约为42 Kda,UBP2成功将GST-Ub52切断,产生大小约为36 Kda的蛋白(阳性对照),与预期大小一致。大鼠USP46表达后将GST-Ub52切断为36 Kda的蛋白,具有去泛素化酶活性,但活性比UBP2低。　　 (5)突变型USP46(C44S)失去去泛素化酶活性,而突变型USP46(△K92)活性降低。突变型USP46(C44S)表达后没有切断模型底物GST-Ub52,而突变型USP46(△K92)切断底物能力下降。应用BandScan图像系统分析结果所示,以阳性对照的切断产物36 Kda蛋白带为标准(亮度定为100),其他几组与之比较,野生型USP46的条带强度为66.90％,突变型LJSP46(△K92)条带强度为47.90％,突变型USP46(C44S)条带强度为0％,突变型USP46(△K92)较野生型活性明显下降。　　 (6)从人类TE-1食管癌细胞株中克隆出usp46基因,人类usp46与大鼠、小鼠的同源蛋白比较发现,和大鼠usp46的同源性达99.7％,仅存在一个氨基酸差异,与小鼠usp46同源性高达100％,并且人类USP46同样具有去泛素化酶活性。　　 结论:　　 (1)克隆出大鼠泛素特异性蛋白酶usp46基因。　　 (2)usp46在大鼠骨骼肌、脑组织、心脏、脾脏、肾脏、肝脏、肺脏中的表达水平存在差异,脾脏中表达最多。　　 (3)表达出GST-USP46融合蛋白。　　 (4)建立了去泛素化酶活性检测体系,检测出大鼠USP46具有去泛素化酶活性。　　 (5)突变型USP46(C44S)失去去泛素化酶活性,而突变型USP46(AK92)活性降低。　　 (6)从人类TE-1食管癌细胞株中克隆出usp46基因,证明其具有去泛素化酶活性,为去泛素化酶的分子流行病学研究奠定基础。