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目的:本研究将探讨自噬对脊髓损伤后神经元细胞修复的调控及作用机制,揭示低频电刺激联合针刺夹脊穴对脊髓损伤后神经元细胞自噬干预作用,为脊髓损伤后尿潴留的修复提供理论基础。材料与方法:1.雌性SPF级SD大鼠50只,随机分为5组,每组10只。分别是空白组(K):不做任何处理;假手术组(J):只暴露脊髓硬脊膜,不给予打击;模型组(M):只给予Allen’s打击,不采取任何治疗;低频组(D):进行Allen’s打击,打击造成脊髓损伤尿潴留模型后24h进行治疗。治疗部位分为两组,共计4个电极片:第一组2个电极片,将电极片的负极放置在大鼠耻骨之上膀胱区,将正极片放置在大鼠第3个骶椎位置上;第二组2个电极片放置脊髓损伤处上、下节段的夹脊穴,正级在上,负极在下,输出波形为三角波,低频电刺激(50Hz),根据电流强度最大不超50m A,以出现适度肌肉收缩为度,20min/次,1次/d,连续干预7d;低频+针刺组(DZ):先进行Allen’s打击,打击造成脊髓损伤尿潴留模型,24h后进行治疗,先进行低频电刺激(50Hz)治疗,10min后采用毫针(0.35×25mm)直刺入T6、T9、T11夹脊穴2mm,留针20min,针刺期间不给予补泻手法,不通电,1次/d,连续干预7d。尿动力学记录治疗前后膀胱最大容量并计算差值。透射电镜法观察脊髓组织中自噬情况;免疫荧光法检测脊髓组织中LC3B和P62蛋白表达;免疫组化法检测脊髓组织中NGF、Trk A蛋白表达。Western Blot法检测脊髓组织中PI3K、pAKT、AKT、p-m TOR、m TOR、LC3B和P62蛋白表达,观察自噬在脊髓损伤后尿潴留中的相互作用和机制。2.以改良Allen’s造成脊髓损伤尿潴留大鼠为模型,利用透射电镜法直接观察自噬情况,免疫荧光及Western Blot法检测LC3B、P62蛋白表达间接衡量自噬流,观察低频电刺激联合针刺夹脊穴对脊髓损伤后尿潴留大鼠PI3K/AKT信号通路的影响,探讨其调控细胞自噬进而修复脊髓损伤的作用机制。结果:1.最大膀胱容量治疗前空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组最大膀胱容量分别为1.014±0.107、0.927±0.036、4.110±0.165、4.114±0.150、4.284±0.201。与空白组比较,假手术组最大膀胱容量未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组最大膀胱容量显著升高(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组和低频组最大膀胱容量均未见差异(n=6,P>0.05);与低频+针刺组比较,低频组最大膀胱容量未见差异(n=6,P>0.05)。治疗后空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组最大膀胱容量分别为1.037±0.116、0.937±0.026、4.023±0.173、2.503±0.160、3.497±0.277。与空白组比较,假手术组最大膀胱容量未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组最大膀胱容量显著升高(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组和低频组最大膀胱容量均显著降低(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组最大膀胱容量显著升高(n=6,P<0.01)。治疗前后空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组膀胱容量差值(d)分别为-0.023±0.036、-0.010±0.013、0.087±0.052、1.611±0.212、0.786±0.135。与空白组比较,假手术组膀胱容量差值(d)未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组膀胱容量差值(d)显著增高(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组和低频组膀胱容量差值(d)均显著增高(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组膀胱容量差值(d)显著降低(n=6,P<0.01)。2.电镜下观察脊髓组织形态空白组和假手术组细胞核结构完整,核膜清晰,线粒体形态基本正常;与假手术组比较,模型组核膜欠清晰,线粒体出现空泡化并伴有自噬现象;与模型组比较,低频+针刺组核膜形态未见差异,线粒体存在空泡化但未见明显自噬现象,低频组核膜形态未见差异,但明显可见空泡化的线粒体并伴有自噬现象。3.免疫组化法检测脊髓组织内NGF表达量的观察NGF表达主要部位在细胞胞浆和细胞核内,呈棕黄色或褐棕色颗粒。空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组NGF灰度值分别为621.375±54.255、614.780±43.754、473.651±66.564、597.441±36.070、545.574±39.440。与空白组比较,假手术组NGF表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组NGF表达显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组NGF表达显著上调(n=6,P<0.01),低频组NGF表达上调(n=6,P<0.05);与低频+针刺组比较,低频组NGF表达下降(n=6,P<0.05)。4.免疫组化法检测脊髓组织内Tr KA表达量的观察Tr KA表达主要部位在细胞胞浆和细胞核内,呈棕黄色或褐棕色颗粒。空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组Tr KA灰度值分别为701.770±26.727、698.174±24.618、461.207±85.214、630.975±66.938、576.011±63.233。与空白组比较,假手术组Tr KA表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组Tr KA表达显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组Tr KA表达显著上调(n=6,P<0.01),低频组Tr KA表达上调(n=6,P<0.05);与低频+针刺组比较,低频组Tr KA表达未见差异(n=6,P>0.05)。5.Western Blot法检测脊髓组织内PI3K蛋白表达空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组PI3K蛋白含量分别为1.073±0.024、1.068±0.034、0.487±0.025、0.994±0.013、0.701±0.015。与空白组比较,假手术组PI3K蛋白表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组PI3K蛋白表达显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组、低频组PI3K蛋白表达均显著上调(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组PI3K蛋白表达显著下降(n=6,P<0.01)。6.Western Blot法检测脊髓组织内p-AKT含量空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组p-AKT/AKT比值分别为0.753±0.036、0.782±0.034、0.643±0.028、0.788±0.019、0.700±0.015。与空白组比较,假手术组磷酸化水平未见差异(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组磷酸化水平显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组、低频组磷酸化水平均显著上调(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组磷酸化水平显著下降(n=6,P<0.01)。7.Western Blot法检测脊髓组织内p-m TOR含量空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组p-m TOR/m TOR比值分别为1.099±0.066、1.121±0.081、0.776±0.035、1.044±0.040、1.029±0.031。与空白组比较,假手术组磷酸化水平未见差异(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组磷酸化水平显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组、低频组磷酸化水平均显著上调(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组磷酸化水平未见差异(n=6,P>0.05)。8.Western Blot法检测脊髓组织内LC3B蛋白表达空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组LC3B蛋白含量分别为0.500±0.009、0.493±0.013、1.509±0.020、0.611±0.017、1.099±0.009。与空白组比较,假手术组LC3B蛋白表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组LC3B蛋白表达显著上调(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组、低频组LC3B蛋白表达均显著下降(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组LC3B蛋白表达显著上调(n=6,P<0.01)。9.Western Blot法检测脊髓组织内P62蛋白表达空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组P62蛋白含量分别为1.473±0.010、1.472±0.013、1.033±0.008、1.347±0.008、1.093±0.023,与空白组比较,假手术组P62蛋白表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组P62蛋白表达显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组、低频组P62蛋白表达均显著上调(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组P62蛋白表达显著下降(n=6,P<0.01)。10.免疫荧光法检测脊髓组织中LC3B表达空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组LC3B平均光密度分别为0.608±0.069、0.622±0.284、0.969±0.039、0.673±0.043、0.776±0.053。与空白组比较,假手术组LC3B表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组LC3B表达上调(n=6,P<0.05);与模型组比较,低频+针刺组、低频组LC3B表达均显著下降(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组LC3B表达显著上调(n=6,P<0.01)。11.免疫荧光法检测脊髓组织中P62表达空白组、假手术组、模型组、低频+针刺组、低频组P62平均光密度分别为0.627±0.045、0.608±0.039、0.362±0.068、0.597±0.061、0.506±0.061。与空白组比较,假手术组P62表达未见异常(n=6,P>0.05);与假手术组比较,模型组P62表达显著下降(n=6,P<0.01);与模型组比较,低频+针刺组、低频组P62表达均显著上调(n=6,P<0.01);与低频+针刺组比较,低频组P62表达下降(n=6,P<0.05)。结论:1.低频电刺激可通过抑制自噬治疗大鼠脊髓损伤尿潴留,低频电刺激联合针刺夹脊穴治疗效果更好。2.脊髓损伤尿潴留与神经元细胞自噬水平上升有关。3.通过治疗使脊髓损伤尿潴留大鼠脊髓神经元细胞NGF及其受体Tr KA增殖,并激活下游的PI3K/AKT/m TOR通路介导自噬,促进该信号通路磷酸化水平,抑制细胞自噬的发生。