HIV-1型病毒是一类反转录病毒,其基因组包含两条(+)RNA单链(大小约为9.8kb)。病毒的复制由多个步骤构成,其中病毒的反转录(reverse transcription)过程非常关键。HIV-1型病毒通过反转录,将基因组单链RNA转变成双链DNA,以便能够整合到宿主基因组中。病毒的反转录过程包括两次链转移(strand transfer)事件。本论文的研究对象为病毒的第一次链转移(first strand transfer)。HIV-1型病毒基因组的5’端与3’端有一段重复序列(Repeat sequence, R),它对病毒进行反转录起到很重要的作用。基因组5’端有一个引物结合位点(Prime Binding Site,PBS),长度为18个核苷酸。第一次链转移起始于宿主tRNA(Lys,3) 3’端的18个核苷酸与该PBS区域的杂交,并且在反转录酶(reverse transcriptase, RTase)的作用下,沿着基因组从3’到5’的方向复制R-U5区域。U5区位于R序列和PBS区域的中间,是5’端的特异序列(unique sequence)。以病毒基因组R-U5区域为模板反转录出来的DNA被称为强终止DNA (strong-stop DNA, ssDNA)。链转移的发生还依赖于RTase的RNase H活性,可以降解已被复制的RNA模板。当5’端的RNA被降解完后,新生成的DNA就会被转移到基因组的3’端。通过ssDNA与3’R序列的互补配对,病毒才能继续反转录。经过这一关键步骤,病毒才得以将基因组全长的信息都逆转录成宿主细胞可以辨识的DNA信息。链转移事件在RNA供体(RNA donor)和RNA受体(RNA acceptor)的水平上发生,它主要依赖于负链DNA和RNA受体的杂交反应。同时,链转移的效率又受到相应核酸二级结构的影响。深入了解这一步骤,将对研究病毒反转录过程以及基因重组有非常重要的意义。其实,链转移事件是病毒基因重组发生的重要原因。病毒的基因重组往往导致病毒能够产生针对某些抗病毒药物的特殊抗性,这已经成为抗HIV-1型病毒治疗方法中的一个大问题。HIV-1型病毒的核衣壳蛋白(HIV-1 nucleocapsid protein, NC)强烈促进了链转移的发生。NC蛋白(由55个氨基酸组成)是病毒的Gag基因前体的水解产物。在具有感染性的病毒粒子中,基因组RNA的表面约覆盖有1000-1500个NC蛋白,这相当于每一个NC蛋白能覆盖12-18个核苷酸。NC蛋白含有两个“锌指”结构,并由一段碱性序列相连。NC蛋白具有核酸伴侣活性,即它可以促使一个核酸分子形成热力学上最稳定的结构。通常来说,就指形成一种含有最多碱基配对的二级结构。这样一种核酸伴侣活性,主要表现为两种行为：一种是由锌指结构介导的去稳定性作用；还有一种是由蛋白N端与中间碱性序列介导的核酸聚集作用。NC蛋白优先与RNA或DNA单链区域的UG以及TG序列结合。这一结合特异性主要依赖于NC蛋白的第二个锌指结构和鸟苷酸(G)的相互作用。目前,在第一次链转移事件中主要涉及到的DNA和RNA序列已经得到确定：分别为RNA R序列——TAR和polyA以及互补的DNA r序列cTAR和cpolyA。第一次链转移的发生主要依靠的R序列被预测可以形成TAR和polyA这两种“茎—环”结构。相关ex vivo研究很大程度上提示,从被病毒感染的细胞或者是病毒粒子中抽提出来的基因组RNA的3’端存在TAR“茎—环”结构。相对而言,3’端polyA序列的二级结构在ex vivo水平上是否存在,尚未探明。另-ex vivo研究发现,如果cTAR序列没有完全生成,那么细胞内几乎观察不到链转移的发生。因此,链转移的发生需要细胞首先完整地合成ssDNA。其他的研究也同时表明,ssDNA的结构也许在链转移事件中起到了很重要的作用。与TAR和polyA序列互补的DNAr序列也被预测可以折叠成cTAR和cpolyA两种“茎—环”结构。而这些二级结构很有可能在第一次链转移发生前就已经形成。而第一次链转移非常可能就是依托于ssDNA和3’端RNA的杂交来完成的。但是到目前为止,关于ssDNA与病毒基因组RNA 3’端发生退火的机制,具体来说,就是这两个具有空间结构的核酸分子的退火方式与机制,尚未完全探究清楚。基于对核酸二级结构的预测,目前主要被大家接受的是两种退火模型。第一个模型是由荷兰阿姆斯特丹大学Berkhout博士领导的研究组提出的“环—环”作用。这一模型认为,链转移起始于TAR-cTAR和polyA-cpolyA两组“环”配对的相互作用,又称为“吻式(kissing)"模型。在另一个由法国斯特拉斯堡大学Mely小组提出的模型中,链转移的起始被认为是从cTAR和TAR“茎—环”结构的“茎”的底部开始的,又称为“拉链(zipper)"模型。这一假说是通过仅代表TAR序列的短片段RNA和DNA分子的研究结果建立的,因此仍值得推敲。至此,我们想要提出的第一个问题就是：全长ssDNA中,这些被预测出来的二级结构是否真实地存在?目前,上面提到的这两种退火模型尚没有得到完全地确认,本论文希望能够可以对这两种模型的确立或否定提出相关看法,亦或提出新的模型概念。此外,NC蛋白在链转移起始阶段中的作用也还不清楚,值得研究。本研究主要是确定DNA的二级结构,因此必须确定DNA的单链和双链区域。为此,我主要会用到一些分子生物学工具以及三种以DNA为靶向的结构探针[包括高锰酸钾(KMnO4), DNaseI和绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease, MB)]。DNase I是一种酶结构探针,能在双链区域形成单链酶切。MB也是一种酶探针,只能在DNA和RNA的单链区域形成单链酶切。最后一种结构探针KMnO4是化学探针。化学探针相对于体积较大的酶探针而言,更容易与核酸反应,不受空间位阻的影响。KMnO4能够修饰非配对的胸腺嘧啶(T)或者是位于“茎”最底部的T。这些被修饰的T可以通过吡啶(piperidine)的处理被从序列中剔除,从而成为一个标记。结构研究首先需要确立结构探针的最适浓度。一般认为有效的结构分析数据源自于在核酸分子上最多切一次的结构探针。从统计意义上来说,就是用同位素32P标记的核酸分子中,占总体60-70%的分子不应该被结构探针识别。此外,确立二级结构除了由结构探针识别并标记的片段以外,还需要有核酸测序图谱作为平行对照,以便识别结构探针标记的位点。本论文主要采取的是Maxam-Gilbert法制备ssDNA的核酸测序图谱。如果DNA的5’端用同位素32P标记,由结构探针识别并生成的片段与核酸测序的电泳图谱位移可能不同,特别是当结构探针酶切生成的片段过小的时候,该酶切片段与测序图谱的位移差异可达1-1.5个碱基。这主要是因为,由酶探针识别并生成的片段会携带一个3’OH基团,而核酸测序产物的3’端为磷酸基团。因此,本论文探讨并摸索出3’端DNA标记的方法,可以使酶切产物与核酸测序产物具有相同的长度,以及相同的尾部基团。只有这样,我们才能准确地判断核酸的二级结构。除此之外,对于结构分析另一个比较重要的影响因素是镁离子的浓度。本论文主要探讨三种不同镁离子浓度下的核酸结构：1)0.2 mM-病毒感染的细胞内镁离子浓度尚不知晓,但是未被感染的细胞内镁离子浓度约为0.2 mM；2)2mM-是体外实验中反转录和链转移发生的最低浓度；3)7 mM-是体外实验中反转录和链转移发生的最有效浓度。本论文的主旨在于研究第一次链转移过程中起始步骤中涉及到的结构与功能的相互关系。因此,本论文主要从以下三个方面进行探究：1)确立cTAR DNA片段的二级结构以及NC蛋白在此DNA片段上的结合位点；2)确立全长ssDNA与3’UTR RNA的退火机制；3)确定ssDNA的空间二级结构,即ssDNA的cTAR及cpoly(A)序列是否能形成“发夹”结构,并研究NC蛋白在ssDNA上的结合位点。首先,我们在没有NC蛋白参与的条件下获得了cTAR DNA的二级结构模型。使用结构探针对这一DNA片段进行研究分析发现,在没有NC蛋白参与的情况下,cTARDNA能折叠成两种不同的含有顶部环和中部环的“茎—环”结构,并形成动态平衡。事件采用"zipper"途径的可能性,因为我们将cTAR序列的3’端与5’端进行了互换。实验数据显示,在0.2 mM MgCl2条件下,三种突变型ssDNA与3’UTR的退火效率并无很大差异。2mM MgCl2浓度并不影响ssDNA-INV突变型与3’UTR的退火效率。相反,该浓度下ssDNA-SL2的退火效率略有下降,而ssDNA-SL1(顶端环含6个碱基突变)的退火效率下降了约1.8倍。ssDNA-S与ssDNA-L在突变型退火效率的变化上基本没有太大差异。由实验结果可以推测,在0.2 mM MgCl2条件下,ssDNA与3’UTR的退火过程可能从多个位点起始。而在2 mM MgCl2浓度下,退火事件的发生可能主要依赖于TAR与cTAR发夹顶端环状结构的相互配对作用。此外,研究结果还发现ssDNA-S与3’UTR的退火效率要高于ssDNA-L,以此提示在2 mM MgCl2浓度下这两种ssDNA的二级折叠可能是不同的。因此,对ssDNA的结构分析将更有助于我们理解ssDNA与3’UTR的退火过程。在研究ssDNA二级结构前,我们需要利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)来鉴定ssDNA的构型。电泳结果显示,在0.2 mM MgCl2浓度下ssDNA呈现两条带。我们推测在此浓度下,ssDNA至少存在两种构型。相反当MgCl2浓度升高到2mM或者利用电泳缓冲液中的EDTA螯合样品孵育液中的镁离子时,两种ssDNA都只跑出一条带,说明在这两种离子条件下,ssDNA很可能只存在一种构型。构型研究结果提示,在低浓度镁离子(0.2 mM)条件下,ssDNA存在的两种构型很可能形成动态平衡。当镁离子浓度升高或者镁离子被EDTA螯合的情况下,平衡体系很可能会发生偏移,使得ssDNA的构型趋于单一化。利用三种结构探针获得的实验数据显示,在0.2 mM MgCl2浓度下,ssDNA-S和ssDNA-L都会形成两种构型,且不同构型间的差异很有可能是由cTAR序列的折叠方式造成的——cTAR序列会形成一个长“茎”结构或者一个短“茎”结构。当MgCl2浓度达到2 mM时,ssDNA-S和ssDNA-L都只形成一种构型,且其中cpolyA和cTAR序列的折叠方式一致。对比ssDNA-S和ssDNA-L的数据发现,两者折叠差异出现在u5区域。这种差异是由cPBS序列造成的,因为它只存在于ssDNA-L中。事实上,ssDNA-L3’端的cPBS区域的TGG序列与u5区的CCA序列发生配对,因此形成了不同于ssDNA-S的一个三碱基配对的结构。当NC蛋白加入到系统之后,我们发现核酸结构对酶探针的敏感性下降,推测在两种不同MgCl2浓度下,ssDNA-L的3D结构可能也是不同的。此外,结构探针对于cTAR“茎”部结构的敏感性下降明显,因此这个区域很有可能是NC蛋白的优先结合区域。综上所述,cTAR和cpolyA序列在全长ssDNA中的确存在。但在0.2 mM MgCl2浓度下,ssDNA可以形成两种构型：其中一种构型u5区与r区能形成8个碱基配对,而另外一种u5区与r区可形成11个碱基配对。但是,在cTAR DNA中观察到的闭合构型与“Y”构型并不存在于ssDNA中。以此可知,cTAR作为单独序列与作为ssDNA的一部分来说,其二级结构是不一致的。因此,之前通过分析cTAR DNA获得数据并建立的模型并不能够完全解释第一次链转移的退火机制。以后的研究应该采用更长的核酸片段,才是研究的更合适的模型。此外,在全长ssDNA中,NC蛋白则更倾向于结合在cTAR和cpolyA两个发夹结构中间的单链区域。这个NC蛋白的结合区域很可能对形成互补的DNA与RNA发夹结构的退火发生起到重要的作用。我们的实验数据显示,NC蛋白是ssDNA与3’UTR的退火机制所必需的。在ssDNA中至少存在3个退火起始位点,分别是：3’端,cTAR和cpolyA的顶部环状结构。我们的结果提示低浓度MgCl2的情况下,这三个位点都可能参与到链转移的起始。2 mM MgCl2浓度下,有50%的ssDNA以cTAR和TAR顶部环结构的相互作用起始链转移。